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1、,非洲猪瘟实验室诊断,国家外来动物疫病研究中心 中国动物卫生与流行病学中心,African Swine Fever, ASF,定义,非洲猪瘟是家猪、疣猪、欧洲野猪和美洲野猪的一种传 染性极强的出血性疾病。所有年龄的猪都易感。 世界动物卫生组织,可表现为最急性、急性、亚急性和慢性四 种形式 严重程度与毒株、猪种及流行时间的长短 有关 急性型以高热、食欲废绝、皮肤发绀、网 状内皮系统出血为特征，发病后2-10天内 死亡，病死率可高达100% 临床上，与古典猪瘟非常相似，难以区分 目前没有疫苗！,2017/5/15,只感染猪 家猪和欧亚野猪非常易感 感染后存活的猪可能变为无症状的携带者 非洲的野生宿
2、主能持续感染很长时间并且 没有临床症状 软蜱是自然界中的贮主并且可以作为传播 媒介 法典中将非洲猪瘟的潜伏期定为15天。,2017/5/15,重要性 OIE动物卫生法典要求必须报告的动物疫病 我国动物疫病名录一类动物疫病 我国中长期动物疫病防治规划（2012-2020年） 明确重点防范的外来动物疫病,病原 非洲猪瘟病毒科中唯一成员 Asfarviridae Asfivirus ASFV 兼具虹彩病毒和痘病毒的某些特性 唯一核酸为DNA的虫媒病毒 只有一个血清型,特点之一：基因组大,170190kb,蓝耳病病毒 15kb 12 倍,猪瘟病毒 12kb 15 倍 Genome CSFV,口蹄疫病毒
3、 8kb 24 倍 Genome FMDV,病原,病原 特点之二：基因多变 基因组两端各有一个高变区，基因型多达22个,特点之三：抵抗力强,温度： 60 20分钟； 56 70分钟 25-37 数周 4 1年 冻肉 数年到数十年,pH： 411.5 无血清 413.4 有血清 未熟肉品、腌肉、泔水中可长时间存活,病原,乙醚、氯仿等脂溶剂可破坏囊膜使其失活,临床症状,最急性型 急性型 亚急性型 慢性型,2017/5/15,临床诊断,最急性型 无临床症状，突然死亡 急性型（强毒株） 发烧（41-42C） 食欲减退 不愿活动 局部皮肤变红或变蓝色 腹泻 呕吐 呼吸困难 流产,死亡率高（10-100%
4、）,仔猪发生ASF，耳、鼻、唇、腿发红，神经症状，数小时内死亡。 Mityana, Uganda, 2010,临床诊断,亚急性型（中等毒力毒株）,症状同急性型，但较轻 死亡率低 持续时间长（3周）,慢性型（低毒力毒株）,消瘦或发育迟缓，体弱 偶见体温升高，波状热 呼吸困难，湿咳 怀孕母猪流产 多处皮肤局部红斑、溃疡 耳部、腹部、大腿内侧可能凸起或坏死 易继发感染，如继发引起肺炎和关节炎 感染后能康复，但终身带毒 死亡率低，可见血清转阳,临床诊断,各种毒力的毒株均可导致流产 胎儿可能全身水肿 胎盘、皮肤、心肌或肝脏可能有淤血点,诊断 病理诊断,脾脏 肿大 易碎 暗红色至黑色,胃、肝、肾各部位淋巴
5、结肿 大、出血；,水肿 肺、肝、膀胱 胆囊充盈 结肠系膜,肾皮质出血点、出血斑,出血 瘀点 瘀斑,慢性型,纤维素性心包炎，并可见出血点,肺局部肉变，实变,肺部局部肉芽肿，形成结节,图1：ASF 猪尸体底部的发绀病变。图2：耳尖的发绀病变。,图3： 血性腹泻 （血痢）。,图4：急性ASF 死猪肺小叶间的水肿。,图5：胃的基底膜淤血（急性） 图6：典型肿大脆化脾。 （黑浆果脾，急性ASF）,图7：病猪脾（上）与正常脾大小的比较。（急性ASF） 图8：急性ASF 猪肿大的褐色脾。（巴西品种）,图9：肾淤斑及出血点（急性）,图10：肾盂及肾乳头部的出 血斑（急性）,图11：肾盂处散在的出血点（急性AS
6、F ） 图12：肿大、出血的肝胃淋巴结，可出见有血凝块。（急性）,图13：肝胃淋巴结切面，肿大并呈暗红色。（急性ASF） 图14：心包积液及心包肌层有散在的出血点。（急性ASF）,图15：胆囊水肿（急性ASF）,图16：肺部可见肉芽肿病变， 形成一结节（慢性ASF）,图17：肺实变区（慢性ASF）,图18：心包脏层附有纤维素， 而且可见出血点（慢性ASF）,鉴别诊断,高致病性蓝耳病 猪皮炎肾炎综合征（PDNS）由PCV-2引起 细菌性败血症 香豆素中毒 真菌毒素中毒 。,2017/5/15,Virus Ab,感染,表现出临床症状,携带者,病毒血症: 感染后2-3天到8天，持续很长时间（数月）
7、特异性抗体: 从感染后的7-11天至数月，甚至数年 排毒:从 感染早期（第2天）以后持续很长时间。甚至康复后。,ASF感染的主要特征,猪 (野猪和家猪) 软蜱,实验室诊断,实验室诊断,病原学,血清学,病毒分离 血细胞吸附试验,直接免疫荧光法 （FAT）,普通PCR和荧光定量 PCR,双抗体夹心ELISA测 定ASFV抗原,间接ELISA测定ASF 特异性抗体,阻断ELISA检测ASF 特异性抗体,唯一确诊单位：国家外来动物疫病研究中心,免疫印迹,间接免疫荧光测抗体,实验室诊断,血清样品,析出的血清,不合格血液样品 分离好的血清单独 包装，并一一编号,合格血液样品,实验室诊断,病原学样品 抗凝血
8、 淋巴结 脾脏 肾脏 骨髓,实验室诊断的安全原则,保障人员的安全 穿戴：眼罩、手套、实验服、口罩和鞋套等 行为：洗手、禁止聊天，实验室内禁止食用食 物和饮料等 了解化学试剂的特性和潜在的危险 保障样品的安全 防止样品交叉污染 一次性手套,2017/5/15,良好的工作区域,第一步 实验前清洁试验区域（台面、移液器等） 注意消毒剂的期限 第二步划分不同的区域 样品处理（BSL-3提取病毒DNA） PCR检测（Mix配制、加DNA、扩增等） ELISA检测区域（加血清、洗涤、终止等）,2017/5/15,GLP (good laboratory practice),原则 制定一整套标准以确保质量、
9、可靠性和完整性， 可核查结论和可追溯性数据的报告。 要点 资源：组织、人员、设施和设备 特征：检测项目和测试系统 规则：试验步骤、标准操作程序（SOP） 结果：原始数据、最后报告和档案 质量保证：独立监测的研究过程 2017/5/15,实验室诊断技术储备,278bp,257bp,英国Pirbright 实验室比对实验,建立了猪瘟、非洲猪瘟的荧光定量PCR鉴别诊断方法,双抗体夹心ELISA检测抗原,阻断ELISA检测抗体,间接ELISA检测抗体,间接ELISA检测病毒抗原,商品化试剂盒INGEZIM K3 (Ingenasa, Spain) 价格比PCR便宜 不需要复杂的操作 适用于基层实验室
10、敏感性低（慢性或亚急性）,2017/5/15,分子生物学检测方法,O20u17r/a5,/1C5 . A., L. Edwards, and C. A. Batten. 2013. Virological diagnosis of African swine fever-comparative study of available tests. Virus research 173:150-158.,荧光PCR检测病毒DNA,荧光PCR工作单 样品的可追溯性！,2017/5/15,荧光PCR检测病毒DNA-试剂准备,病毒DNA提取试剂盒,非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒,荧光PCR检测病毒DN
11、A-试剂制备,冻干蛋白酶K: 将蛋白酶K溶解在4.5 ml灭菌后的 蒸馏水中，将溶液以500 l分装，在 -10C温度下 储存，直到使用。 除抑制物缓冲液: 将20 ml无水乙醇加入原始小瓶 中混匀并进行相应的标记和日期记录。室温储存。 冲洗缓冲液: 将80 ml无水乙醇加入原瓶中混匀并 进行相应的标记和日期记录。室温储存。,荧光PCR检测病毒DNA-仪器设备,水浴锅或金属浴 匀浆仪和匀浆管（陶珠） 台式离心机 荧光PCR仪 移液器,荧光PCR检测病毒DNA-样本处理,组织样本 取100 mg组织剪碎，加入1 ml PBS研磨或匀浆，然后1050 g或2000 rpm离心10分钟取上清,全血（
12、抗凝血）或血清 直接吸取200 l,提取病毒DNA,将200 l结合缓冲液（绿盖）和40 l蛋白酶K（20 mg/mL）加入到1.5 ml离心管中。 加入200 l样本。每个提取程序都加入E+ 和 E- (200 l水)对照。 立即混匀并在722C 温度下孵育10分钟。 将1.5 ml微离心管简单离心操作，除去管盖内部的 水珠。 将100 l异丙醇加入样本试管，混匀。 将过滤管放入收集管中，并将样本移入过滤管。,提取病毒DNA （2）,将过滤管以8000 g离心1分钟。如果样本依然留在过滤管中， 重复离心操作。 扔掉收集管，将过滤管加入干净的收集管中。 将500 l除抑制物缓冲液（黑盖）放入过
13、滤管，以8000 g离心 1分钟。 扔掉收集管，将过滤管放入干净的收集管中。 将500 l冲洗缓冲液（蓝盖）加入过滤管，以8000 g进行1分 钟离心操作。 扔掉收集管，重复冲洗步骤（500 l冲洗缓冲液加入过滤管 ，以8000 g进行1分钟离心操作）。 扔掉收集管，将过滤管放入干净的收集管中。以13,000 g进 行10s离心操作以去除残余的冲洗缓冲液。 扔掉收集管，将过滤管放入干净的1.5 ml微离心管中。,提取病毒DNA （3）,将50 l100 l预热的消毒蒸馏水加入过滤管（ 注意不要使用试剂盒中Elution buffer），以8000 g 进行1分钟离心操作。 将DNA溶液在-10
14、C温度下储存（有效期：12个 月），备用；如果DNA溶液在1-2小时内用于PCR 操作，在43C温度下短暂储存，然后冻存。,荧光PCR检测病毒DNAOIE方法,配制反应体系： 反应液溶解后，每个反应管中加入18 l反应液， 然后再加入2 l模板； 每次试验需设立反应阳性对照（R+，绿管中的反 应阳性对照）和反应阴性对照（R-，灭菌水）,荧光PCR检测,程序设置,荧光PCR检测病毒DNA-实验结果,荧光PCR检测病毒DNA-结果判定,有效性：提取阳性对照（E+）和反应阳性对照R+的 Ct值应小于35，且提取阴性对照（E-）和反应阴性对 照（R-）无Ct值，则试验有效。 阳性和阴性：当样品的扩增结
15、果有典型的扩增曲线且 Ct值小于37时可判定为阳性。当样品的扩增结果在背 景信号之下或Ct值37时，判定为阴性结果。 可疑样品：当样品的Ct值大于35小于37并且扩增曲线 呈指数时被判定为可疑，当扩增曲线呈线性时判为阴 性。可疑样品应当重新提取病毒核酸检测，如仍为可 疑，可判为阳性。,实时荧光RPA,重组酶聚合酶扩增技术 等温扩增（3742C） 用时短：20分钟 灵敏度高 操作简单，便携式仪器,2017/5/15,实时荧光RPA检测ASFV,特异性强 与其他病毒无交叉反应 敏感性高 能检测出不同基因型的毒株,2017/5/15,实时荧光RPA检测ASFV,2017/5/15,与荧光PCR具有较高的相关性 概率回归分析：最低可检测出17个拷贝,ASFV的基因型,22个基因型 非洲22个型：西非I型为主，东非基因型复 杂 欧洲- I型意大利撒丁岛，II型东欧和俄罗斯,2017/5/15,2017/5/15,血清学检测方法,没有疫苗！ 抗体=感染 没有中和抗体。 感染早期既可以检测出抗体（7- 12dpi） 抗体持续很长时间,2017/5/15,血清学检测方法,筛选（Screening by ELISA t
