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1、发酵菌种的来源与选育,第一节 菌种的来源,根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。,从自然界筛选,自然界中菌种分离的一般过程,土样的采取, 预处理, 培养, 菌落的选择, 产品的鉴定,如何使样品中所含微生物的可能性大,如何在后续的操作中使这种可能性实现,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,问题：,分离思路,新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理
2、先进的设备与之配合。,定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。,新菌种分离与筛选的步骤,（一）采样,1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品
3、，某些水域等。,采样和采集方法,为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。,采样的注意事项,1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；,5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中
4、的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长,1土样采集方法,森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集； 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面515cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。 在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。,2植物体采集方法,在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。
5、 选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。 采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。,3水样采集方法,用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。 由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。 方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4下贮存。,（二）增殖培养,为了容易分离到所需的菌种，
6、让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。,（三）培养分离,尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，因此，建立一更为科学的和针对性强的分离方法是必要的。,分离富集方法,运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组
7、，可以建立起若干富集技术。 富集可以促进抗性的产生并维持下来。,土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。 植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂布平板。 水中细菌的分离：水样通过0.22m无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。,次代培养及纯化步骤,1、涂布的平板经培养后，菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。 2 通过高倍放大进行镜检，则按涂布不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落
8、对琼脂平板进行分类。,次代培养及纯化步骤,2、将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行影印培养。 3、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。 4、将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离琼脂平板上进行筛选。,（四）筛 选,这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。,生产选种,是在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐
9、显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。进行类似新种筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。,（五）毒性试验,自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。,第二节 工业菌种的育种,是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。,菌株选育的目的,提高生产能力,提高产品质量,开发新
10、产品,解决生产实际问题,防止菌种退化,基因突变：,自然选育、诱变育种,基因重组：,杂交、原生质体融合、基因工程,基因的直接进化：,点突变、易错PCR、同序法 DNA Shuffling等,工业菌种育种的方法,自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9,自然突变有两种情况：,一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。,另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。,一、自然选育,自然选育在工业生产上的意义,自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。,回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的
11、丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变,问题：,高产菌株是正突变高，还是负突变高？,自然选育操作步骤：,一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。,单细胞(孢子)悬液的制备,平板分离,挑选单菌落(注意形态的观察),发酵试验,诱变育种,用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。,诱变剂： 能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂,诱变剂,物理,化学,一、诱变剂和诱变处理,物理诱变剂：射线如紫外线、X射线、射线，快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安
12、全。,化学诱变剂： 化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。 化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。,化学诱变剂的优缺点,1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效 2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射行工作时，设备费用大，并要注意安全性。 3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎.,二、诱变育种步骤,出发菌株的选择 处理菌悬液的制备 诱变处理 中间培养 分离和筛选,(一)出发菌株的选择,1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。 2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像
13、，也是良好的出发菌株。 3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。 4出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。,5要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。 6根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。,(二)处理菌悬液的制备,这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心
14、，洗涤，过滤。,(三)诱变处理,根据有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。,化学诱变剂使用过程的安全性,诱变剂量的选择,(四)中间培养,由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。,方法： 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落
15、，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。,(五)分离和筛选,筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异. 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。 (6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。,基因育种,基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因
16、，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另个细胞的方法。,基因的直接进化(directed evolution),突变 基因突变库的建立 筛选 基因突变库的筛选 基因复制与遗传,步骤：,在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。,选择育种方法时综合考虑的因素,(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式或连续发酵试验)； (2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的明了程度； (3)经济费用。 如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术： 如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。,工业菌种改良方法,(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出新的代谢步骤，由
