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1、基因组DNA的分离和纯化,一、实验目的,1、掌握利用碘化钾法提取外周血细胞DNA的方法 2、学会使用低温高速离心机、漩涡振荡器、核酸/蛋白质定量紫外分光光度计。,二、实验原理,1.碘化钾法提取DNA的原理：利用氯化铵形成的低渗环境破坏红细胞，后经碘化钾短时间破坏白细胞及其核膜，再通过氯仿/异戊醇等蛋白变性剂沉淀蛋白质、脂质及残存细胞碎片，最后异丙醇沉淀基因组DNA，乙醇洗涤并除去异丙醇，提取的基因组DNA用TE溶解。,2.DNA纯度的鉴定原理：由于核酸中的碱基都具有共轭双键，因此具有紫外光吸收性质，核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在260nm处，吸收低谷在230nm处。蛋白质在
2、紫外区的吸收高峰在280nm处。因此核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。,三、实验器材与试剂,仪器：低温高速离心机、漩涡振荡器、核酸/蛋白质定量紫外分光光度计、移液枪（100ul，200ul,1000ul） 试剂：0.9%NH4Cl 、PH8.0的TE缓冲液 、生理盐水、氯仿、异戊醇、异丙醇，无水乙醇，5mol/L碘化钾。,四、实验步骤,(一)DNA的提取 1、取EDTA-K2抗凝血300L加入到1.5 mL Ep管中,加1ml0.9%NH4Cl,充分混匀后静置5分钟，待液体至变清亮后，以12000r/min的转速低温（4）离心5 min，弃上清，留沉淀。 2、加5 mol/L K
3、I溶液70L于Ep管中，于漩涡振荡器上混匀30s-1min，让沉淀充分混匀。,4、加入300L 的0.9%NaCl溶液，混匀 5、加入450L氯仿/异戊醇( 24：1,v/v)混合液，振荡混匀1-2min 。 6、12000r/min低温（4oC）离心5 min，吸取水相层，转移到新的Ep管中； 7、加入180L异丙醇于Ep管中，轻轻混匀，12000r/min低温（4oC）离心5 min，,8、弃上清，加无水乙醇1.0 mL，放置5-10min，12000 r/min低温（4oC）离心5 min，弃去无水乙醇，待干燥。 9、加入25LPH8.0的TE缓冲液溶解DNA。,五、实验结果观察,1、吸
4、取5ulDNA样品，加PH8.0的TE缓冲液至100ul，混匀后，装入紫外分光光度计的一次性比色杯中。 2、用100ul的PH8.0的TE缓冲液为空白管调零。 3、读取仪器显示的A260与A260/A280两个值,4、DNA浓度=A260x20x50/1000（ug/ul） ； DNA纯度=A260/A280。 5、数据显示，A260/A280的比值为1.8是高纯度的DNA的标志，一般临床上取A260/A280比值在1.8-2.0之间。若低于1.8则表示有蛋白质（芳香族）或者酚类物质污染，需要纯化样品，如果比值偏高，高于2.0表示有RNA污染。 。,六、注意事项,1.实验过程中每一步都要小心温和的操作，避免剧烈的吸取、震荡、混匀 2.由于试剂有毒、腐蚀性，为避免实验过程中引起灼伤，操作时必须戴手套、防护镜及防护衣,七、思考题,1，DNA的提取和纯化，最后测定DNA纯度的时候，为什么取A260/A280的比值？,
