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1、昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白 杆状病毒表达系统介绍 杆状病毒蛋白表达系统的优势 杆状病毒表达载体系统（BEVS） 杆状病毒表达宿主细胞 表达优化条件 翻译后修饰对蛋白表达的影响 高通量表达 总结 杆状病毒介绍杆状病毒介绍 1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状 DNA病毒。 2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态： 一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另 一种为包含体病毒（Occlusion derived virus, OV）。 3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。 4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子
2、。 5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedrosis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。 6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。 杆状病毒生命周期杆状病毒生命周期 早期（早期（06h PI） 病毒通过内吞作用进入细胞 核衣壳迁移到细胞核 病毒DNA释放 开始早期基因表达 晚期（晚期（624h PI） 更多DNA复制 新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质 的过程中得到囊膜蛋白 产生新的出芽病毒 极晚期极晚期 出芽病毒减少 核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MN
3、PVs MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形 成包含体病毒。 多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。 Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia 优点缺点优点缺点 大肠 杆菌 大肠 杆菌 成本低、表达量高。 缺乏蛋白质翻译后加工 机制；目的蛋白不可溶， 蛋白生物活性低。 酵母酵母 表达量高，可以翻译后 加工，易实现高密度发酵。蛋白质量不理想。 哺乳动 物细胞 哺乳动 物细胞 重组蛋白生物活性高。 成本高；表达水平低， 技术和环境要求高。 昆虫 细胞 昆虫 细胞 重组蛋白生物学活性高； 表达
4、水平高；能同时表 达多个基因。 重组蛋白糖基化程度低。 RTS 快速，无需克隆，表达量高。成本高。 酵母酵母 哺乳动 物细胞 哺乳动 物细胞 昆虫细胞昆虫细胞 RTS体外表 达系统 RTS体外表 达系统 大肠杆菌大肠杆菌 昆虫杆状病毒与其他蛋白表达系统比较昆虫杆状病毒与其他蛋白表达系统比较 在辉瑞制药公司，杆状病毒是其第二 大蛋白表达系统。 杆状病毒系统表达重组蛋白的优势杆状病毒系统表达重组蛋白的优势 表达量高（可达细胞总蛋白的50%），大多数为有生物功能的可溶性 蛋白； 可进行翻译后修饰； 可进行磷酸化修饰； 可形成正确折叠的二硫键； 可进行N和O型糖基化修饰； 可去除信号肽； 易进行规模化
5、生产，昆虫细胞比哺乳动物细胞操作简单； 相对于其他真核表达系统成本较低； 杆状病毒表达系统（杆状病毒表达系统（BEVS）的发展）的发展 BEVS系统由Dr. Max D. Summers, and Dr. Gale Smith在1982年研究提出； BEVS系统基于目的基因替代病毒基因组上一个极晚期，非必须的病毒蛋白 （多角体蛋白）； 大多数的转移载体使用早期启动子（le1）或极晚期启动子（p10， pPolyh）； AcMNPV DNA的改造和线性化是BEVS历史性改造； 对于分泌性蛋白，HBM 和gp67是最常用的分泌信号肽； BEVS允许在昆虫细胞（Sf9, Sf21, Hi5）中快速克
6、隆和表达重组蛋白。 杆状病毒表达系统（杆状病毒表达系统（BEVS） BactoBac (Invitrogen) 杆状病毒表达系统（杆状病毒表达系统（BEVS） BacPAK6/BaculoGold (BD Biosciences/Clonetech) E.coli lacZ 基因插入到多角体位点 引入多个Bsu361限制性酶切位点 Bsu361限制性酶切位点的引入使得病毒 DNA (ORF1629)在昆虫细胞中不能复制 Bsu361不能100%切割病毒DNA使之线性化 重组病毒仍需要进行空斑筛选 杆状病毒表达系统（杆状病毒表达系统（BEVS） BaculoDirect (Invitrogen)
7、 利用Gateway技术直接将目的基因转移到病 毒DNA上 目的基因整合到病毒DNA的polh位点 利用整合酶和特异位点（att）完成整合 利用更昔洛韦（核苷类似物）筛选重组病毒 更昔洛韦被HSV1 tk磷酸化后阻止野生型病毒 基因组的复制 需要大量病毒扩繁 每次只能生产一种重组基因 杆状病毒表达系统（杆状病毒表达系统（BEVS） flashBAC/BacMagic (EMD/OET/Nextgen) 用人工细菌染色体（BAC）改造polh位点，使 得病毒基因组可在大肠杆菌中复制 ORF1629的删除阻止非重组的父代病毒不能在 昆虫细胞中复制 chiA基因的删除提高了分泌通路的效率 适合自动化
8、生产 不需要空斑纯化 不同不同BEVS系统比较系统比较 flashBAC系统是一个全新的生产重组杆状病毒的技术平台，flashBAC专门设计，免 去了从亲代病毒中筛选重组病毒的步骤，不需要进行空斑实验，一步法杆状病毒蛋 白表达系统，目前最领先的杆状病毒表达系统。 OET专业开发第二代杆状病毒表达系统专业开发第二代杆状病毒表达系统 表达系统表达系统 flashBACTM flashBAC GOLDTM flashBAC ULTRATM flashBAC PRIMETM 全球领先的重组蛋白表达 系统，简单、快速、产量高。 病毒滴度滴定试剂盒病毒滴度滴定试剂盒 baculoQUANTTMALLINO
9、NE 准确，快速测定病毒滴度。 病毒转染试剂病毒转染试剂 flashFECTINTM baculoFECTINTM 专用于昆虫细胞的高效转染试剂。 培养基培养基 baculoGROWTM 昆虫细胞专用无血清培养基。 转移载体转移载体 pOETTMtransfer plasmids 简化的克隆和同源重组技术。 更简单：无需繁琐的筛选工作 更快速：一步法，只需5天 更高的蛋白产量：蛋白更稳定 更高的蛋白活性：蛋白生物活性高 适用于难表达的蛋白：分泌蛋白， 膜蛋白， 毒性蛋白 flashBAC 表达系统： 主要产品： 表达系统： 主要产品： 杆状病毒重组及转染步骤杆状病毒重组及转染步骤 4 mlSF
10、 900 II培 养基中加 培 养基中加100 g Bacmid DNA 和和100 l CELLFECTIN 20 ml Sf9 细胞细胞 (1X106 vc/ml)，摇床 培养 ，摇床 培养 45 min 移除未结合移除未结合DNA 加 入 加 入25 ml新鲜培养基新鲜培养基 27C 摇床培养摇床培养72h 移除多余培 养基（ 移除多余培 养基（P0代 病毒），过 滤除菌 代 病毒），过 滤除菌 在在1L新鲜新鲜sf9 细胞细胞(2 X106vc/ml)中加入中加入 10mlP0代重组病 毒，培养 代重组病 毒，培养 72h 重组病毒储存液重组病毒储存液(1X107vc/ml) 蛋白纯化
11、 蛋白性质分析 活性分析 晶体实验 蛋白纯化 蛋白性质分析 活性分析 晶体实验(表达量表达量 10 mg/L) 6天内天内 杆状病毒杆状病毒DNA的选择的选择 杆状 病毒 杆状 病毒 DNA 改 造改 造 应用应用 chiAvcathP10/ P26 / P74 flashBAC高效表达分泌蛋白或膜蛋 白 flashBAC GOLD 降低蛋白降解；提高分泌 蛋白和膜蛋白定位效率 flashBAC ULTRA 提高polh转录提高蛋白产 量及胞内蛋白稳定性；降 低蛋白降解；利于蛋白分 泌和膜蛋白定位 flashBAC PRIME 转染极晚期时细胞 裂解 提高假病毒粒子的产量， 也适合胞质蛋白的表
12、达 flashBACGOLD BactoBac (Invitrogen) 杆状病毒宿主细胞杆状病毒宿主细胞 常用的昆虫细胞常用的昆虫细胞 细胞系细胞系来源来源应用应用培养基培养基 Sf9Spodoptera frugiperda Sf9 (Pupal ovarian tissue) 重组杆状病毒生产 胞内蛋白表达 空斑分析 Sf900II/III SFM HyQ SFX Sf21Spodoptera frugiperda Sf21 (Pupal ovarian tissue) 胞内蛋白表达 重组分泌蛋白 Sf900II/III SFM ESF921 HyQ SFX Hi5Trichoplusi
13、a ni Hi5 (Ovarian cells) 重组分泌蛋白EXCELL 405 Express Five SFM HyQ SFX TriExSf9 derivative胞内蛋白表达TriEX OET公司提供的昆虫细胞公司提供的昆虫细胞 昆虫细胞昆虫细胞特性特性应用应用 Sf21 cells普通昆虫细胞普通情况蛋白表达 Sf9 cells普通昆虫细胞普通情况蛋白表达 Super Sf91 cells基因改良昆虫细胞提高重组蛋白的稳定性，适合胞内蛋 白，膜蛋白，分泌蛋白。 Super Sf92 cells基因改良昆虫细胞提高重组蛋白的稳定性，尤其是毒性蛋 白和易降解蛋白。 Super Sf93
14、 cells基因改良昆虫细胞提高重组蛋白的稳定性，毒性蛋白，膜 蛋白，分泌蛋白。（如未知特性的蛋白） 杆状病毒宿主细胞杆状病毒宿主细胞 表达条件优化表达条件优化 温度对昆虫细胞生长的影响温度对昆虫细胞生长的影响 表达条件优化表达条件优化 宿主细胞对分泌性蛋白的表达影响宿主细胞对分泌性蛋白的表达影响 蛋白表达水平随目标蛋白的不同也有所不同 表达条件优化表达条件优化 ( ) N a B u ( ) N a B u + 2m M Na Bu 24h pi + 2m M Na Bu 48h pi ( ) N a B u ( ) N a B u + 2 m M Na Bu 24h pi + 2 m M
15、Na Bu 48h pi M 17 45 67 93 117 17 45 67 93 117 温度对蛋白表达及稳定性的影响温度对蛋白表达及稳定性的影响 24C27C20C27C 诱导时间诱导时间 hr 在在Sf21细胞中表达重组蛋白 在 细胞中表达重组蛋白 在Sf9细胞中表达重组蛋白细胞中表达重组蛋白 表达条件优化表达条件优化 培养基和培养基和MOI对蛋白表达的影响对蛋白表达的影响 MOI在1和5时对蛋白表达没有明显区别 不同生长培养基会影响蛋白表达 不同蛋白表达量也有所不同 表达条件优化表达条件优化 常用的融合标签蛋白常用的融合标签蛋白 标签蛋白标签蛋白大小大小纯化柱纯化柱特性特性 His6
16、10 aaIMAC 1. 最常用的纯化标签 2. 代谢负荷低 3. 洗脱条件温和 4. 可在天然或变性条件下纯化 5.成本低/结合能力强 FLAG8 aa (DYKDDDDK) Anti FLAG M2 AB 1. 代谢负荷低 2. 特异性高 3. 亲和填料昂贵 4. 洗脱条件严格 GST26 kDaGlutathione GST affinity 1. 代谢负荷高 2. 特异性高 3. 亲和填料价格低 4. 洗脱条件温和，结合能力高 Strep8 aaStrepTactin Streptavidin 1.酶生物素化效率多变 2.洗脱条件温和 3.亲和填料价格高 Split SUMO （6 His） 6 kDaIMAC
