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1、Chapter 3 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme,酶的提取与分离纯化,Contents of chapter 3,1、酶的提取与分离纯化技术路线,2、细胞破碎,3、酶的提取,4、酶的分离方法,Go,Go,Go,Go,5、酶的组合分离纯化策略,Go,6、酶的浓缩、干燥与结晶,Go,细胞结构与酶分布,酶的提取、分离纯化,酶的提取、分离纯化是将酶从细胞或培养基中取出，再与杂质分开，而获得与使用目的、要求相适应的有一定纯度的酶产品的过程 基本原则 一、防止变性失效 二、可以采用比一般蛋白质分离更多更有效的方法和条件 三、提取
2、、纯化的每一步都应进行酶活力的检测,3.1 酶的提取、分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。,注意点,1.除了少数例外，所有操作都应在低温下条件下进行，尤其在有有机溶剂存在时更应特别小心 2. 大多数酶在pH 10的情况下不稳定，故必须控制整个系统不要过酸或过碱；同时要避免在调节pH时产生局部酸碱过量的现象。 3.酶和其它蛋白质一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作中应尽量减少泡沫形成。 4.重金属、有机溶剂等能使酶变性失效，微生物污染、蛋白水解酶的存在
3、能使酶分解破坏，所有这些也都应予以足够的重视。,3.2 细胞破碎 许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。 1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎,JY92-II D超声波 细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,机械破碎,捣碎法 研磨法 匀浆法,物理破碎,温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法,化学破碎,有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween,酶促破碎,自溶法 外加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞
4、破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,本章 目录,超声波破碎法,利用超声波的机械振动而使细胞膜上所受张力不均而破碎。,Fig. Sonicator,酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、
5、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。,3.3 酶的提取,提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。,为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。,酶的主要提取方法,大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。,本章 目录,影响提取的主要因素,温度 温度对酶的提取效果影响明显，适当提高温度，可以增加酶的溶解度和分子扩散速度，但温度过高会引起酶的变性失活。采用有机溶剂时，温度控制在低温
6、条件下。室温下提取的有酵母醇脱氢酶，细菌碱性磷酸酶，胃蛋白酶。因此在不影响酶的活性条件下，适当提高温度，有利于酶的提取。 溶液的对酶的溶解度和稳定性有显著影响，不同的酶会带不同的电荷及其带的电荷量不同，酶在等电点的溶解度最低，故提高溶解度应该避开等电点，但不能过高过低。 提取液的体积 增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。过量的提取液会使酶浓度降低，对分离纯化不利。所以提取液总量一般为原料体积的体积，最好分几次提取。 在酶的提取过程中，体积小，颗粒的比表面积大，扩散面积大，有利于提高扩散速度，适当的搅拌和适当的延长时间，可使酶更好的溶解出来。注意为了保护酶的稳定性，可加某些保护剂，如与酶作用的
7、底物，辅酶，某些抗氧化剂。,分离方法的选择,为了获得理想的分离效果应注意： 工作前应对所要纯化的酶的理化性质(溶解度、分子大小和解离特性)以及酶的稳定性等有一个较全面的了解。 判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活力测定为准则。 要严格控制操作条件，防止变性。,3.4 酶的分离,酶的分离纯化方法,现有的酶的分离纯化方法都是根据酶和杂蛋白在下列性质上的差异建立的。 性质 方法 分子大小 离心，超离心法、凝胶过滤， 膜分离技术（超滤，反渗透， 微孔过滤，透析，电渗析等） 溶解度 盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀法， 选择性沉淀法，结晶 电荷或基团 离子交换色谱，电泳，等电聚焦， 吸附 色谱，疏水色
8、谱，聚焦色谱 稳定性 选择性变性法（热，酸碱， 表面活性剂） 特殊（专一性结合） 亲和色谱，亲和洗脱，亲和电泳,酶的分离方法,1、沉淀分离,2、离心分离,3、过滤与膜分离,4、层析分离,Go,Go,Go,Go,5、电泳分离,Go,6、萃取分离,Go,本章 目录,1、沉淀分离,沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。,盐析沉淀法,盐析法是最古老的，但也是目前仍广泛采用的方法。 盐析法根据的原理是：球蛋白在低盐浓度的溶液中，溶解度随盐离子强度升高而增大，表现“盐溶(salting in)”的特性。但是当盐浓度继续升高，并超过某一上限
9、时，其溶解度又会先后以不同速度下降，分别“盐析(salting out)沉淀析出。 盐析纯化法就是根据酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别差别而建立的一种纯化方法。,球蛋白溶解度-溶液离子强度关系,盐析,中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因： 1).中和蛋白质分子表面电荷 2).与蛋白质颗粒竞争水分子 不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不同，因而可以分级沉淀。 盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋白质浓度在1mg/ml以上，低温。 此法优点：简便，安全，重现性好 缺点：分辨率低，纯度提高不显著，同时为了下一步纯化，有时还需要脱盐。,盐析,盐析法的一个发展就是和色谱技术相结合形成盐析色谱
10、法(salting out chromatography)，即以琼脂糖等非极性物质为柱色谱的支持体，在高浓度条件下将样品中的蛋白质盐析吸附，然后再梯度地降低盐类浓度，使酶和杂蛋白分别洗脱出来。 这种技术的优点是纯化量大，重复性好，分辨率高较。,盐析,蛋白质和酶在溶液中的溶解度，与溶液中的离子强度有关： Log(S/S0)=-KsI LogS=LogS0-KsI=- KsI S-蛋白质或酶在离子强度为I 时的溶解度（w/v) S0-蛋白质或酶在离子强度为0时的溶解度 Ks-盐析常数 I -离子强度,盐析,在一定的温度和pH条件下（为常数），通过改变离子强度的方法可使不同的蛋白质或酶分离，称为KS
11、分段盐析。 在一定的盐和离子强度条件下（Ks、I为常数 ），通过改变温度或pH值使不同物质分离，称分段盐析。,盐析,蛋白质盐析沉淀中，常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠、和磷酸钠等，硫酸铵最常用。 不同的酶，盐析时所需的盐浓度个不相同。酶的来源、酶的浓度、杂质的成分等对盐析时所需的盐浓度也有所影响。 经盐析后的酶沉淀，含有大量盐分，需采用透析、超滤或层析等方法进行脱盐。,等电点沉淀法,原理：利用两性电解质在等电点时溶解度最低和不同的电解质具有不同的等电点的特性，通过调节溶液的PH，使酶或蛋白质沉淀析出，从而使酶和蛋白质分离的方法。 等电点时，两性电解质分子的静电荷为零，分子间
12、的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。 由于在等电点时，两性电解质表面的水化膜依然存在，故实际上酶等大分子蛋白质仍有一定的溶解性，从而使沉淀不完全。在实际中，此法经常与其他方法一起使用，如等电点经常与盐析沉淀，有机溶剂沉淀，和复合沉淀一起使用。单独使用时，主要是从粗酶中除去某些等电点相差较大的蛋白质。 加酸碱时，一边搅拌一边慢慢加进，防止局部过酸过碱一起蛋白质变性。,等电点沉淀法,如：纯化动物材料抽提液中的酶时，可将pH先调整至5左右，待放置片刻后，核蛋白等颗粒杂质就会沉淀析出，使酶溶液达到“一步澄清”。 又如：纯化血清胆碱脂酶时，可先将pH先调至2.83.0，除去酸性杂蛋白。,有机溶
13、剂沉淀法,有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子间的静电引力，导致蛋白质的溶解度下降；也可与水作用使蛋白质脱水而趋于凝集、沉淀。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度差异而分离的方法称有机溶剂沉淀法。 应考虑： 温度 pH 离子和离子强度 有机溶剂 此法优点：分辨率高，溶剂易除去。 缺点：温度控制不当时易引起变性。,本节 目录,有机溶剂沉淀法,用于蛋白质纯化的有机溶剂中，丙酮的分离效果最好，引起失效的情况比较少。除丙酮外，乙醇和甲醇等也常用。 有机溶剂浓度通常以百分体积表示，加入量可按下式计算：V = Vo* (S2-S1)/(S-S2) V 应加入的有机溶剂体积 Vo原溶液的体积
14、S2所要达到的有机溶剂百分浓度 S1原溶液中有机溶剂的百分浓度 S待加有机溶剂的百分浓度,复合沉淀法,定义：在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物沉淀下来，从而使酶和杂质分离的方法称为复合沉淀法。 常用的复合沉淀剂：单宁，聚乙二醇，聚丙烯酸 例： 菠萝蛋白酶与单宁复合可以制成药片，用于治疗咽喉炎 复合物有的可以直接中使用，有的用适当的方法，使酶从复合物中析出进一步纯化。,复合沉淀法,利用离子型表面活性剂如SDS、非离子型表面活性剂如聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）、聚乙烯亚胺以及单宁酸、硫酸链霉素等，在一定条件下能与蛋白质直接地形成络合物，使蛋白质沉淀析出，然后再
15、用适当方法使需要的酶溶解出来，除去杂蛋白和沉淀剂，从而达到纯化的目的。,复合沉淀法,以聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)纯化限制性内切核酸酶RE. EcoR I为例。 在该酶生产菌株的超声破碎离心上清液中，包含大量的DNA和杂蛋白。PEI在0.2mol/L KCl的条件下，能和DNA以及与之相关的蛋白质一起凝聚沉淀析出；但当KCl的浓度上升至0.6 mol/L时，虽然PEI与DNA及杂蛋白仍处于沉淀状态，而RE. EcoR I却能重新溶解，因此可将酶和杂蛋白分离开来，使RE. EcoR I得到初步纯化。,选择性变性沉淀法,定义：选择一定的条件使杂蛋白变性沉淀，而不影响所需
16、酶的方法。 方法：热处理，改变PH或加入某些金属离子 应用此法必须对与分离的酶以及酶液中的杂蛋白的种类含量及其物理和化学性质有较全面的了解。,本节 目录,2、离心分离,离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。,常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。,高速离心机的最大转速为（12.5）104 r/min ，相对离心力达到 11041105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造
