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1、临床细菌室的基本条件及操作技术,细菌实验室 完成标本的接种、孵育、分离鉴定和药敏试验等。,兽医微生物学检验基础,苏敬良 中国农业大学动物医学院,临床细菌学实验室必须符合以下条件,1. 安装严密的门窗，以防止外部污浊的空气和昆虫进入室内污染环境。室内禁用电扇（根据需要可安装空调）。 2. 必须安装有供空气消毒的紫外线灯，置于离工作台面1m 的高度，每天开始工作前照射20分钟。 3. 分别备有洗手和标本处理水源及消毒剂水盆。 4. 常备消毒剂，对菌液污染的台面和地面进行消毒处理。,5. 室内台面每天用消毒剂进行消毒，地面每周至少消毒1次。 6. 室内对接收的标本和消毒过的器具要分别指定地点放置，特
2、别是对无菌和有菌器具要明显隔开。用过的试管、平皿必须及时高压灭菌处理。 7. 不能或不便高压灭菌的标本和废弃物品必须焚化处理 8. 配备必要的消防设备,基本设备和器具,温箱、高压灭菌设备、CO2培养设备 厌氧培养设备 冰箱、显微镜、离心机、天平、 pH计、 接种器具、火焰灯 各种玻璃器皿、各种塑料器皿,孵育温箱 可调温度范围为室温至60，真菌则为25- 26 显微镜 普通光学显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜 CO2培养设备 CO2培养箱 烛罐（缸 ）3%-5% CO2 化学试剂产气法：按每升体积加枸橼酸0.33g、碳酸氢钠0.37g 两试剂混合于小烧杯置于罐中加入10ml蒸馏水立即将罐封闭。,
3、基本设备和器具,厌氧培养设备厌氧箱、厌氧罐和厌氧袋 造成无氧环境有物理方法和化学方法： 物理方法抽气-换气： 真空泵将厌氧罐抽气至负压80-93Pa，然后充入混合气体（CO2 10%、H210% 、N2 80%）或氮气，再抽气换气，反复3次，最后充入混合气体即为无氧环境。 化学方法：在厌氧罐内放盛催化剂的容器，内装化学试剂为硼氢化钠和碳酸氢钠-枸橼酸合剂。在封闭厌氧罐之前，加水到化学试剂中，立即封闭，化学反应产生氢气和CO2。,物理和化学方法提供的氢气经催化剂钯的作用，与氧气化合成水，把氧除去，造成无氧环境。 厌氧设备中放置氧化还原指示剂，提示是否为无氧状态，如美蓝指示剂，无氧时，指示剂不显颜
4、色，有氧时，为蓝色。,接种器具 接种环和接种针：镍铬丝或300W电炉丝制备 火焰灯：煤气灯或酒精等 平皿：60、90、100mm 高压灭菌设备 冰箱和冷藏柜,基本染色方法,革兰氏染色 抗酸染色 碱性复红法（Ziehl-Neelsen法） 鞭毛染色 墨汁荚膜染色,基本分离培养基,培养基按其性质和用途不同，可以分为以下几类： 基础培养基(basic medium) 含有细菌所需的基本营养成分，可供大多数细菌生长。最常用的基础培养基是肉浸液，即新鲜的牛肉浸出液，加入适当的蛋白胨、氯化钠、磷酸盐，调节pH7.2-7.6。, 营养培养基(Nutrient medium)在基础培养基中添加一些其它营养物质
5、，如葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏、生长因子等可供营养要求较高的细菌生长。又称增菌培养基(Enrichment medium)。 鉴别培养基（Differential medium）利用各种细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物，观察细菌在其生长后分解底物的作用如何，从而鉴别细菌。, 选择性培养基（selective medium）在培养基中加入某种化学物质，使之抑制某一类细菌生长，而有利于另一类细菌生长，从而将后者选择出来。 厌氧培养基(anaerobic medium) 专供厌氧菌的分离、培养和鉴别用 进行厌氧培养的办法，一是将普通培养基放在无氧环境中培养
6、，或者在培养基中加入还原剂以降低培养基的氧化还原电势，并在培养基表面用凡士林或石蜡封住，与空气隔绝，使培养基本身成为无氧的环境，这就是厌氧培养基。如疱肉培养基（cooked meat medium）,基本的生化鉴定培养基及诊断血清,生化鉴定试验 氨基酸或含氮物质的分解试验 糖类的分解试验 有机酸盐利用试验 生长抑制试验 基本诊断血清 沙门氏菌诊断血清 致病性大肠杆菌诊断血清 链球菌Lancefield诊断血清,临床微生物室的任务和职责,一、建立正确、快速的检验方法 建立正确快速的分离和鉴定方法 为达到这一目的，临床细菌室应作到以下几点： 1.选择国际公认的分离及鉴定参考方法和试剂作为实验室的常
7、规试验 2. 在分离和鉴定的各步骤设立完整的室内质量监控体系 3 建立临床菌库 建立正确的药敏试验方法 选择正确的方法 药敏结果的审核和药敏规则的标准化,二、与临床建立密切联系 建立带有评论和注释的细菌学报告 制定标本采集指南和规则 参与治疗方案的制定 获取临床资料 及时将开展新试验、新技术与临床人员沟通。 三、 不断提高细菌学基础理论水平,临床细菌室的质量控制,实验室前的质量控制 制定标本采集指南 包括标本的采集、运送和采集时间等。 标本接种培养前的质量控制 检查采集的标本是否合格 分离培养的质量控制 标本采集、运送、分离培养基的质量和是否及时接种, 培养基的质量控制 常用仪器的质量控制 培
8、养箱、高压灭菌器、细菌鉴定系统、血液分析系统 药物敏感试验的质量控制 染色液及染色方法的质量控制,培养基的制备,校正pH 分装 质量检查 无菌检验、效果检验 保存（1周内）,高压蒸汽灭菌,压力与温度的关系,压力,kg/cm2,磅,温度（）,0.35 5 108 0.70 10 116 1.05 15 121 1.40 20 127,分离病原微生物的基本要领,一、重视标本送检申请单 记录标本的来源、送检的目的、临床诊断（主要症状等），认真做好登记工作。,二、正确采集和处理标本 注意事项 采取血液、脑脊髓液或穿刺液时应严格无菌操作，避免杂菌污染。 粪便、肛拭子、鼻咽拭子应放置与灭菌容器内尽可能避免
9、标本外细菌混入。 应在使用抗菌素前采集标本。 盛标本的容器不得用消毒剂或酸碱类消毒处理。 尽快送检，或根据分离病原的不同保存于适当的温度条件下，如冷冻等。 采集、包装和送检过程中要注意安全,三、选择适宜的培养基是分离出病原菌的重要环节,四、认真区分污染菌 观察菌落是否在划线上 每次培养需要做无菌对照 结合拟培养的细菌生长特点去对照判断（菌落的形状、大小、色泽、边缘、透明度、湿润度、溶血现象等） 注意观察培养时间，如布鲁氏菌、支原体、钩体、结核分枝杆菌的生长缓慢。 涂片染色检查，观察是否与目的菌一样。,分类学的目的在于将所有的生物按其相似性进行归群，并依据各群间的亲缘关系的密切程度排列成一个等级
10、系统，这个系统应尽可能反映各生物种群间自然的系统演化关系，每个种群在这个系统中都应有正确位置。 命名是按照国际准则给每个物种一个（唯一的）公认的名称 鉴定则是确定一个新分离物的特征，并将其归属于已存在的分类单位的过程,分类、命名和鉴定（分类学中的三要素）,Bacteria domain has been subdivided into 23 phyla (28 classes) with the exception of Cyanobacteria and Actinobacteria,鉴定细菌的程序和要点, 获得并确论细菌的纯培养； 按照从大（如科或属）到小（如种）及至特异性的范畴顺序测定细
11、菌的各种特性； 正确分析所有有价值的结果以便确定所鉴定细菌的属种可能性； 自始至终用相同的标准进行实验操作和判断结果； 以尽可能少的实验及结果作出细菌鉴定； 必要时通过比较自己分离得到的菌株与标准的参考菌株的实验结果，验证本实验室所作实验条件是否可靠和鉴定方案是否正确。,PURE CULTURES why? if the culture is not pure the results will be a composite from all of the different organisms in the culture and thus can be very misleading. Cr
12、iterions of purity similar colonies exception: S-R variation, capsular variation, pigmented/nonpigmented variation Morphological similarity,Purity of cultures,Rough and smooth colony types of P. luteola after 48 hours.,Smooth and Rough Colony Variants of Shigella sonnei,Golden pigment-producing stap
13、hylococci (left),Pseudomonas aeruginosa colonies on agar,Capsule surrounding cells of Streptococcus species,传统分类法,根据生物的共性和特性进行分门别类。将生物的基本特性分为主要和次要，然后依据主次顺序编制双岐图表和检索表，一次一次往下分，指导最小区分单位。由于分类中选择将定力强的生化特征为基础，所以传统分类也成为偏重性鉴定方法。主要一形态特征、培养特征及生理生化特性等表观分类学指征对微生物分类单位进行描述分类,细菌的生理、生化特征 1. 细菌的着色性和形态： G-，G+ 球菌、杆菌、弧
14、菌、螺菌等 2. 生物化学特征 根据细菌的营养方式、代谢产物特点和对分子氧的需求，分别将细菌分为氧化型、发酵型和氧化兼发酵型； 厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌,与传统分类不同，树枝分类以“等重要原则”为理论基础，细菌的生化特征不分主次、总体比较全面分析。选择100-200项生理生化指标，比较结果以相似系数或相似百分数表示。 相似系数=相同特征数/（相同特征数特征+不同特征数 根据相似系数大小，判断细菌种间的亲缘性,数值分类,Numerical taxonomic methods further improved the validity of phenotypic identification b
15、y further increasing the numberof tests used, usually to 100200, and by calculating coefficientsof similarity between strains and species Although there is no similarity value that defines a taxospecies (species determined by numerical taxonomy), 80% similarity is commonly seen among strains in a gi
16、ven taxospecies.,分子分类 DNA碱基组成（G+C mol%)分析 DNA-DNA分子杂交 DNA指纹技术,核酸特征鉴定,1. G+C含量测定 Tm值测定 DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中GC含量越高，Tm值越高，成正比关系。 评价标准是核酸所吸收的光线量达到其所增加吸收260nm光线的量的两倍达到的温度， 当核酸达到Tm值时，其260nm吸收量可增加百分之四十（紫外吸收量随解体程度而增加，直至完全解体。,0.1SSC G+C mol%=2.44Tm-69.3,1 SSC G+C mol%=2.08Tm-106.4,Ribotyping,Ribotyping is a method that can identify and classify bacteria based
