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1、肿瘤血管生成 及检测 重庆医科大学 病理教研室 叶秀峰,人体肿瘤大部分为实体瘤(solid tumors)。实体瘤瘤组织由瘤细胞和间质构成，后者主要包括血管、淋巴管、结缔组织、炎细胞及细胞外基质等成分。其中，血管和结缔组织起营养、支持瘤细胞的作用。,肿瘤内的新生血管和淋巴管分别通过血管生成(angiogenesis)和淋巴管生成(1ymphangiogenesis)实现的，并在肿瘤的生长和扩散(侵袭和转移)中起重要作用。已有研究证明，肿瘤血管生成活跃程度对组织病理分级、放射治疗以及在预后判断上都有重要的评估价值。,第一节 肿瘤血管生成的基本过程 一、血管生成现象 (一)血管生成的概念 1945
2、年Algire提出了“肿瘤血管生成(tumor angiogenesis)”或“血管新生化(neovasclarzation)”概念。对血管生成重要性的认识，特别是提出“肿瘤生长依赖于血管生成”观点，始于1 971年Folkman对肿瘤血管生成的研究报道。,血管生成是指活体组织在已存在的微血管床上芽生(sprouting)出新的以毛细血管为主的血管系统的过程。 有别于胚胎时期由早期内皮细胞分化形成新血管的过程即血管形成(vasculogenesis) (二)血管生成的研究方法 鸡胚绒毛尿囊膜试验 角膜移植实验,开窗实验 动物移植瘤等在体模型 三维胶分析法 细胞联合培养等离体模型 识别内皮细胞的
3、免疫学标记物 :第8因子相关抗原(factorrelated antigenFAg)、CD3l、CD34、CDl05 血管生成因子:VEGF及其受体家族 FGF家族及其受体 Ang和Tie受体家族 Angiotropin 血小板源内皮细胞生长因子(PD-ECGF),二肿瘤血管生成的基本过程 (一)血管生成的基本过程 血管生成的基本步骤是 血管生成因子的产生过多使之与抑制因子失衡，导致内皮细胞激活，产生血管生成表型； 血管部位细胞外基质改变、基底膜降解，内皮细胞芽生、增殖和迁移；,新生内皮细胞索形成管状毛细血管襻及管腔； 新生血管管腔的贯通。内皮细胞凋亡、脱离基底膜和血管壁细胞改变可能是血管消退
4、的主要病理学事件。 (二)肿瘤血管生成的过程 1肿瘤生长的阶段性 无血管期(avascular phase)或称血管前期(prevascular phase) 肿瘤直径不超过12mm,血管期(vascular phase) 肿瘤迅速生长并发生转移 2.肿瘤血管的起源 肿瘤中的血管可能有3种来源： 血管生成:以两种方式发生,一是肿瘤细胞团先处于无血管期生长，后因缺氧而产生大量血管生成因子，从而诱导血管生成；另一种是瘤细胞先依赖宿主组织已存在的血管生长，继而出现瘤内血管消退，然后再因缺氧诱导血管生成因子作用而发生血管生成 血管套叠性生长,内皮祖细胞 3肿瘤血管生成的过程 瘤细胞和巨噬细胞 血管生成
5、因子 (VEGF等) 小血管毛细血管伸展 内皮细胞迁移形成毛细血管芽 新生毛细血管形成并连通,第二节 肿瘤微血管形态和生物学特性 肿瘤微血管不仅在形态上不同于正常血管，而且在生物学功能上也有其特殊性。 一肿瘤微血管形态表现 肿瘤组织内新生的微血管一般遍布整个肿瘤组织，但分布上并不均一。血管生成最活跃、微血管密度最高的区域被称为所谓“血管热点区”(hot spots)，这也是进行肿瘤微血管密度测定的选择区域。很多肿瘤的微血管新生主要分布在肿瘤生长活跃的边缘。,肿瘤的新生血管分布上常常无规律，分支紊乱，管腔不规则，可表现为狭窄、扩张或扭曲。新生血管呈血窦状、条索状，管壁薄，甚至仅有一层内皮细胞；或
6、管壁很厚，但结构上仍然不完善。内皮细胞般比较幼稚，细胞间常有裂隙，且缺乏基底膜，有时血管外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连。 肿瘤血管的结构缺陷是这些血管具有高通透性的结构基础，也是肿瘤转移途径之一。,不同类型肿瘤间质的血管没有本质区别，但在形态和数量上却有不同。 生长活跃的恶性肿瘤常富于血管如内分泌肿瘤肾癌、骨肉瘤、绒毛膜癌、破骨细胞瘤、胶质母细胞瘤和肝细胞癌等，而硬癌、软骨瘤和软骨肉瘤中血管甚少。 不同肿瘤血管的形态又有一定的差异，如胶质母细胞瘤中新生血管不仅丰富，而且内皮细胞呈不同程度的增生、肥大；绒毛膜癌、肝细胞癌等血管呈壁薄、明显扩张的血窦。,以恶性胶质瘤为例，肿瘤组织内新生血管的主要
7、表现形式有: 梭形内皮细胞呈索状排列，枝状分布，有或无明显的血管腔，呈原始、幼稚的微血管 内皮细胞增生、肥大，管腔狭小，呈现厚壁血管 内皮细胞增生，形成球形血管壁内血管呈现“肾小球样结构”； 管腔大、管壁较薄的相对较大的微血管，并形成血管心假菊形团结构； 大量管壁退变和钙化的新生血管；,增生血管丛呈蛇形密集排列，形成肿瘤与瘤周组织间的血管屏障； 血管内皮区域性极度增生，呈片状的梭形细胞，构成“假肉瘤化”。 二、肿瘤微血管的生物学特性 低反应性 高通透性 低供氧能力,最近，Vogelstein B和Kinzler KW采用基因表达的系列分析(serial analysis of gene exp
8、ression SAGE)方法，比较研究了结直肠癌和正常肠黏膜血管内皮细胞的基因表达差异。结果发现二者基因表达存在差异。他们得到了79种差异表达的转录子，其中TEM8仅表达于肿瘤内皮而不表达于黄体形成中的内皮细胞，提示肿瘤血管生成和生理状态下的血管生成有明显不同。这一发现为血管生成的基础和临床研究提供了重要资料，也引起了血管生成和肿瘤治疗研究者的重视。,第三节 肿瘤血管生成的调控机制 肿瘤血管生成受多种血管生成因子(angiogenic factors)和血管生成抑制物(angiogenesis inhibitors)的调控。肿瘤细胞、内皮细胞和巨噬细胞受缺氧刺激等使局部微环境发生变化的因素作
9、用而合成和释放大量血管生成因子从不同环节促进血管生成。组织中同时也存在内源性血管生成抑制因子，对血管生成起抑制作用。,一、血管生成因子 血管生成的始动需要血管生成因子。一系列血管生成因子、细胞因子、细胞外基质和黏附分子及其抑制物，以及代谢性和机械性因子均参与了血管生成过程。 已知的血管生成因子有数十种，其中VEGF和Ang家族是已知的、特异性作用于内皮细胞的生长因子，在血管生成中作用可能也是最为重要的。,(一)VEGF及其受体家族 1VEGF家族及其爱体 VEGF又称血管通透性因子(vascular permeability factor,VPF)，为分子量3445kD的同源二聚体糖蛋白，属于
10、碱性蛋白。VEGF基因通过转录水平的剪切，可产生5种变异体，即VEGF206、VEGFl89、VEGFl65、VEGFl45和VEGFl21，分别由206、189、165、145和121个氨基酸组成。,其中以VEGF165最具特征性，其次是VEGF121二者均为可溶性分泌蛋白，扩散力强，易于到达靶细胞。 近年又发现其他一些与VEGF功能相似、结构上有一定同源性的多肽因子，包括胎盘生长因子(placentor growth factor，PIGF)，VEGF-B(VEGF相关因子，VEGF-related factor， VRF)，VEGF-C(VEGF相关蛋白，VEGF-related pro
11、tein，VRP)，以及VEGF-DFIGF和VEGF-E等成员，它们共同构成VEGF家族,VEGF受体包括VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1KDR)和 VEGFR-3(Flt-4) 2VEGF及其受体的作用 : 早期血管的形成需要VEGF的调节，它们与内皮细胞上相应的酪氨酸激酶受体结合，引起内皮细胞分裂和分化，并形成管腔样结构。 在胚胎发育过程中，VEGF(主要是VEGF-A)通过其受体VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1KDR)促进内皮分化、增殖、迁移和原始血管形成.,由新形成的内皮组装成管腔样结构需要VEGFR-1的表达和激活，而VEGFR-3的
12、表达与内皮细胞形成静脉或淋巴管有关。 VEGF不仅是内皮细胞特异的强效有丝分裂原，而且能促进内皮细胞产生并调节纤溶酶原激活物及其抑制因子；增加血管通透性等特性，在血管生成中发挥重要作用。 VEGF在几乎所有的人体肿瘤和肿瘤细胞株中皆有过表达。VEGF及其受体在肿瘤中的表达常与肿瘤分化程度密切相关。,大多数实体瘤VEGF基因均有过表达，VEGF165 VEGF121两种VEGF最常见。 在VEGF家族中，VEGF-C和VEG-D既可诱导血管生成，又可诱导淋巴管生成。已有研究报道，人体多种肿瘤细胞高表达VEGF-C。 体内转基因实验也证实，肿瘤细胞VEGF-C的高表达能选择性地诱导肿瘤组织淋巴管生
13、成。 肿瘤组织中的VEGF-C和VEGF-D还来源于浸润的巨噬细胞。,缺氧是包括胶质瘤细胞在内的许多细胞系产生VEGF的一个强烈的诱导因子 离体条件下，葡萄糖缺乏亦是VEGF表达的诱因。 VEGF在肿瘤坏死灶周边常呈强表达。 肿瘤中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平常与VEGF呈正相关，NO与VEGF之间具有相互调节作用。 多种癌基因的激活通过上调VEGF表达而诱导血管生成，失活的抑癌基因(如突变型p53基因)也参与了VEGF介导的血管生成过程。,(二)FGF家族及其受体 1FGF家族 目前研究最为深入的是碱性戒纤维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)。bFGF和a
14、FGF在结构上是相关的，二者之间有53的序列同源。 2FGF的分布和生物学作用 bFGF是体内分布广泛的生长因子之一，可在不同肿瘤中表达，包括膀胱癌、神经胶质瘤、肝癌、胃肠癌、乳腺癌、肾细胞癌和甲状腺癌等许多培养的细胞系都可以合成它。,其功能具有多样性，可促进内皮细胞的有丝分裂、趋化性和迁移，刺激内皮细胞产生胶原酶降解基底膜，诱导来源于中胚层和神经外胚层细胞的增殖和分化。bFGF也表现出亲神经性行为，促进神经元的存活和分化。 bFGF和aFGF均与肝素有很强的亲和力，研究表明这种高亲和力对于FGF与细胞表达的受体结合是非常重要的。,3FGF受体 bFGF的生物学作用是通过与其特异性的细胞表面受
15、体FGF受体(FGFreceptors，FGFR)结合而介导实现的。已经识别4种FGFR，包括FGFR-1(flg)、FGFR-2(bek)、FGFR-3和FGFR-4。 FGFR-1在bFGFFGFR系统中的作用最大。正常脑神经元和胶质细胞中FGFR-1的表达呈现明显的异质性，即组织中有些细胞呈现FGFR-1阳性，有些则显示阴性；血管内皮细胞亦是如此。,(三) Angiotropin AngiOtropin是一个含铜离子的45kD核酸与多肽的聚合物。将angiotropin加入到已汇合的毛细血管内皮细胞培养基中，它以剂量依赖方式刺激内皮迁移并快速排列成管样结构，这种效应对内皮细胞是特异的。由
16、于它是巨噬细胞产生的化学调节剂，所以它可能启动炎症和伤口愈合中的血管生成过程。,（四）血小板源内皮细胞生长因子(PD-ECGF) PD-ECGF是一个酸性45kD单链多肽。 它是内皮细胞特异的有丝分裂素，能刺激人和猪的内皮细胞增生。用PD-ECGF转染肿瘤细胞，其裸鼠移植瘤血管密度明显增加。 (五) 其他血管生成因子 Ang和Tie受体家族 EGF TGF 粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(G-CSFGMCSF),(七)降解基底膜的相关物质 血管基底膜的降解是血管生成过程中的重要事件，只有基底膜降解之后，内皮细胞才能迁移入周围组织并形成血管芽。 基底膜的降解是一复杂过程，涉及一系列酶的作用，这些酶包括基质金属蛋白溶酶、尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen,u-PA)；丝氨酸蛋白酶(serine proteases)、细胞外蛋白体(pr
