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1、新型大孔硅质酰胺型聚合物键合相的制备 及其对蛋白质的分离 魏?芸?樊立民?蒋生祥?陈立仁 ?中国科学院兰州化学物理研究所?兰州? 提?要?大孔硅胶与乙烯基硅烷反应后?再与甲基丙烯酰胺和二乙烯基苯共聚成一种新型分离蛋白质的色谱 柱填料考察了这种色谱填料对蛋白质的分离能力?认为其具有柱效高?惰性好和分离效率高的优点?聚合物键 合相的制备重复性好并探讨了流动相中离子强度和?值对蛋白质分离的影响 关键词?固定相?大孔硅胶?酰胺型聚合物键合相?蛋白质分离 分类号? ? ? ? ?前言 由于高效液相色谱法? ? ? ?分离柱效高?选 择性好?因此成为当今分离和分析生物大分子?如蛋 白质?核酸?糖缀合物等?
2、的强有力的手段?蛋白质 的分离在很多方面不同于小分子?其色谱分离的最 佳条件不仅意味着所有组分在短时间内能得到完全 分离?而且要能得到最大的生物活性回收率?因 此?必须详细了解蛋白质在流动相和固定相上的色 谱行为?这与特异性蛋白质在色谱分离中的构象变 化有关分离柱是色谱技术的核心?而对固定相的研 究则是各种? ? ?方法赖以建立和发展的基础近 年来在快速分离生物大分子的? ? ?固定相的研 究中?主要有两个方向?一是采用粒度为? ?的 无孔有机基质或无机基质固定相? ?这类固定相 由于表面无孔?消除了溶质在固定相内部的慢扩散 过程?因而分离速度明显加快?它的不利之处在于难 以装填?柱压较高和柱
3、容量较小?二是可以在高流速 下使用的灌注色谱固定相? ?它是采用悬浮聚合 法得到的超大孔树脂?这种树脂上有两类孔?即大孔 和贯穿孔大孔约? ?贯穿孔为? ?甚至达微 米级在固定相的横断面上?贯穿孔组成了一个网 络?从而缩短了溶质分子的扩散路径灌注色谱固定 相可以达到细粒度无孔固定相的柱效能?柱压较低? 溶质传递的速度与流动相的线速相匹配但有机聚 合物形成的灌注色谱填料的机械稳定性差?而以硅 胶为基质的复合材料机械强度大?有较宽的?适 用范围本文介绍的是孔径为?的硅质酰胺型 聚合物填料?同时还考察了它的物理化学性质及色 谱性能 ?实验部分 ?仪器与试剂 ? ? ? ? ? ?液相色谱仪?德国?
4、? ? ? ?进样阀?定量环?色谱柱? ? ? ? ? ? ? ? ?数据处理机?日本岛津? 装柱机? ? ?型液相色谱柱填充机?四川分析 仪器厂? 载体?自制大孔硅胶? ?孔径? 试剂?二乙氧基甲基乙烯基硅烷?甲基丙烯酰 胺?二乙烯基苯?偶氮二异丁腈均为化学纯?甲苯?甲 醇?乙醚?乙腈?三氟醋酸?四氯化碳为分析纯?水为 去离子水 标准蛋白质样品?胃蛋白酶?核糖核酸酶?葡 萄糖氧化酶及大豆胰蛋白酶抑制剂?购自美国? ? ?公司 ?大孔硅胶基质的制备? 扩孔前硅珠孔径为? 将一定量复盐溶液加 至已选好的硅珠中?使硅珠浸湿后再干燥?于马弗炉 中焙烧一定时间?取出并洗至中性?制得孔径为 ?的大孔硅胶
5、 ?硅胶基质的净化 采用盐酸溶液与硅胶回流?使得硅胶基质表面 的硅氧桥键打开?形成游离的硅羟基?并可除去硅胶 表面的金属杂质?使之净化以待进一步与硅烷化试 剂反应 第?卷第?期色? ?谱? ? ? ?年?月? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 国家自然科学基金资助项目 ?通讯联系人 ?本文收稿日期?修回日期? ?键合乙烯基硅胶及固定相的合成 制备方法见文献?硅胶先与硅烷化试剂反 应?然后与甲基丙烯酰胺?二乙烯基苯共聚?再经抽 滤?洗涤?干燥即可 ?结果与讨论 ?物理化学表征 图?为大孔硅胶和大孔硅质酰胺型聚合物键合 相的红外光谱图 在图?中
6、只有硅胶本身的振动峰?而图? 中有游离的?振动吸收峰? ? ? ? ? ? ?不饱和碳氢的吸收峰? ? ? ? ? ? ?特征吸收峰? ? ? ? ? ? ?剪式振动 吸 收 峰? ? ? ? ? ?苯 环 骨 架 振 动 峰? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?伸展振 动吸收峰? ? ? ? ? ? ? ?甲基碳氢振 动峰? ? ? ? ? ?及 ?非平面摇摆振动峰? ? ? ? ? ? ? ? 由红外光谱图提供的信息可 知?大孔硅质酰胺型聚合物键合相中既有苯环?氨 基?又有羰基 图?红外光谱图 ? ? ? ? ? 大孔硅胶? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?大孔硅质酰
7、胺型 聚合物键合相? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 填料合成方程式如下? ?柱填料制备重复性考察 采用湿法合成?批柱填料?含碳量分别为? ? ? ? ?和? ?可以看出此种合 成柱填料的方法重复性良好 ?色谱性能 色谱条件?流动相?含有? ? ? 的磷酸盐缓冲液?流速? ? ? ?室温? ? ?检测? ? ? ?各蛋白质样品均溶于去离子 水中 在大孔硅质酰胺型聚合物键合相上可于? ? ?色?谱?卷 内等度洗脱?个标准蛋白质?见图?相邻两种蛋白 质的分离度分别为?胃蛋白酶?大豆胰蛋白酶抑 制剂?大豆胰蛋白酶抑制剂?葡萄
8、糖氧化酶? ?葡萄糖氧化酶?核糖核酸酶? 图?种标准蛋白质色谱分离图 ? ? ? ? ?胃蛋白酶? ? ? ?大豆胰蛋白酶抑制剂? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?葡萄糖氧化酶? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?核糖核酸酶? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?以硅胶为基质的键合相填料只能耐?值为? ? ?而? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?等高 分子聚合物可耐?值为? ?我们研制的填料 是将甲基丙烯酰胺键合于硅胶表面?并以二乙烯基 苯为交联剂进行交联?
9、形成聚合物层覆盖在硅胶表 面?流动相与硅胶本身接触小?所以?值适用范围 介于两种填料之间?而机械稳定性优于有机聚合物 ?流动相中盐浓度对分离的影响 在? ?的 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液 中?调 节 ?浓度分别为? ? ? 在?孔径的硅质酰胺型聚合物键合相上?考察 盐浓度对胃蛋白酶?大豆胰蛋白酶抑制剂?葡萄糖氧 化酶?核糖核酸酶的保留时间的影响?结果见表? 表?流动相中?浓度对保留时间? ?的影响 ? ? ? ? ? 蛋白质? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 胃蛋白酶? ? ? ? 大豆胰蛋白酶抑制剂? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 葡萄糖氧化酶? ? ? ? ? ?
10、 ? ? ? 核糖核酸酶? ? ? ? ? ? ? ? ? ?由表?可看出?胃蛋白酶?大豆胰蛋白酶抑制 剂?葡萄糖氧化酶?核糖核酸酶的保留时间随着流动 相中?浓度的增加而增加?但幅度有大有 小这是两种原因造成的?一种为盐析效应?另一种 为蛋白质与流动相中的盐形成离子对而改变了蛋白 质的表面极性?从而影响了蛋白质的保留除了采用 含有? ? ? ?的磷酸盐缓冲溶液外?其 余?种盐浓度均不改变蛋白质的洗脱顺序 ?流动相中?值变化对分离的影响 在含有? ? ? ?的磷酸盐缓冲液中?调节流动 相的?值分别为? ? ? ? ? ?考 察流动相的?值变化对蛋白质保留时间的影响?结 果见图?这里除了流动相改为
11、? ? ?的磷酸盐 缓冲液外?其余色谱条件同? ?项? 由图?可看出?流动相的?值对胃蛋白酶保留 时间几乎无影响?大豆胰蛋白酶抑制剂?葡萄糖氧化 酶的保留时间都是随着?值的增加而降低?而核糖 核酸酶的保留时间却随着?值的增加而增加但三 者增加或降低的幅度都很小 图?流动相中?值大小对蛋白质保留时间的影响 ? ? ? ? 峰序及色谱条件图? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 上述情况的出现是由于不同蛋白质具有各自的 等电点?随着流动相中缓冲液的?值的变化?可引 起蛋白质表面极性的变化胃蛋白酶? ?考察 的流动相?值均大于此值?使得胃蛋白酶表面带有 净的负电荷?致使?值改变对
12、其保留影响不大核 糖核酸酶? ? ?考察的流动相?值均小于此值? 使得核糖核酸酶表面带有净的正电荷?由此看来? 值的改变对其保留时间的影响也应不大但?值的 ?期?魏?芸等?新型大孔硅质酰胺型聚合物键合相的制备及其对蛋白质的分离? 改变对柱填料会产生影响随着?值的降低?增加 了填料的离子化而?值在很大程度上依靠于相对 吸附强度?因此?强保留的蛋白质对?值的改变比 较敏感?核糖核酸酶的保留时间会有所改变大豆胰 蛋白酶抑制剂? ?在考察的流动相?值范围 内?致使蛋白质表面净电荷发生改变?保留相应也产 生变化由于?值改变可对蛋白质表面极性和填料 离子化两方面产生影响?因此很难推测蛋白质的保 留规律保留
13、时间的增减幅度小?可能是合成的酰胺 型聚合物填料比一般的聚酰胺型填料对流动相要求 苛刻程度降低的缘故其大孔网络状结构比刷型结 构减少了与流动相接触的时间 综上所述?大孔硅胶表面键合的甲基丙烯酰胺 以二乙烯基苯为交联剂可交联形成网络状聚合物层 覆盖于硅胶表面?使流动相与硅胶本身接触小?所以 可耐?值范围较宽文献?中所述相似类型填料 可耐流动相?值的范围是? ?大孔硅胶聚合物 键合相对蛋白质分离效果好?分析速度快?在生物大 分子分离分析中具有广泛的应用前景 参考文献 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
