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1、细胞培养技术,Cell Culture,病理（肾脏）实验室 白 洁,细胞培养,概念：取动物组织，在体外，无菌条件下，模拟体内环境（营养、温度、pH值、气体），对其进行培养，使细胞能够生存、生长、保持原来生物学特性的一种实验方法。,内 容,细胞培养的基本条件 细胞培养基本实验,一、细胞培养的基本条件,实验室条件： 环境、设备、器材、试剂 实验操作者工作范畴： 无菌操作、温育、培养液配 置、洗刷、无菌处理、细胞和用品 储存等 back,实验室条件,无菌环境 仪器设备 普通器材 一般试剂,无菌室结构模式图,back,仪器设备,超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮罐、低温冰箱、重蒸水装置、负压
2、真空泵、普通冰箱、消毒锅、烤箱、水浴锅、天平等 back,二氧化碳培养箱 back,超净工作台 back,倒 置 显 微 镜,back,液 氮 罐,back,普通器材,玻璃瓶皿：玻璃瓶、培养瓶、培养 皿、吸管、离心管、抽 虑瓶等 塑料瓶皿：多孔培养板、培养皿、 培养瓶等,back,一般试剂,培养液 平衡盐液 消化液 抗生素液 pH调整液 back,back,培养液,使用培养液： 天然培养基 5-20% 合成培养基 80-95% 附加成分 再加适量抗生素液，调整pH值即可 back,天然培养基,小牛血清 胎牛血清 组织提取液 back,合成培养基,RPMI1640 Eagle培养液：DMEM、M
3、EM、IMDM HamF12、HamF10、 PC199 Mc-Coy5A back,附加成分,促贴壁物：层粘连蛋白等 激素：胰岛素、氢化考的松、GH等 生长因子： ECGF、NGF、FGF等 酶抑制物：大豆胰旦白酶抑制剂等 back,平衡盐液,Hanks D-Hanks Earle PBS HBSS back,消化液,胰蛋白酶 (0.125 -0.25%) 胶原酶 (0.1-0.3mg/ml) EDTA (0.01 -0.02%) back,抗生素液,链霉素 (100ug/ml) 青霉素 (100单位/ml) 制霉菌素 (100单位/ml) 终浓度不超过万分之一为宜 back,pH调整液,5
4、.6%NaHCO2 HEPES 1NHCL 10%HAC 1NNaOH back,无菌操作,洗手 着装 近火焰操作 试剂瓶等斜放,实验前准备,清洗： 玻璃、塑料、橡胶、金属类等 消毒： 无菌室、培养用液、培养器皿（玻璃、塑料、橡胶、金属）等,清洗示意图,白箭头：玻璃制品 黑箭头：橡胶制品,back,消毒方法,物理消毒法：射线、紫外线、干热、 湿热、过滤、煮沸等 化学消毒法：乳酸、甲醛、过氧乙 酸、新洁尔灭、乙醇等 抗生素灭菌,二、细胞培养的基本内容,细胞传代培养* 细胞冻存与复苏*,细胞计数,血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：自动计数 计算：以活细胞计数；成团细胞算一个 细胞数
5、4大格细胞数/4104个/ml 压线细胞计数原则： 数上不数下，数左不数右,常规观察,培养液： 颜色：含有指示剂酚红，颜色反应PH值 新鲜的正常：PH7.27.4，桃红色； 培养后，细胞产酸，变黄，需换液； 透明度：清亮透明，混浊多为污染（悬浮细胞除外）,培养液短期内变黄：,1、是否有细菌污染； 2、可能培养皿没清洗干净，有残留物； 3、细胞生长太快； 4、细胞接种量过大。,细胞的生长状态,贴壁细胞 随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。 细胞在生长期常有1-2个核仁，在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。
6、 若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等，表明细胞代谢不良。,悬浮细胞 圆形，可以单个细胞或聚集成团生长； 细胞透亮，核、膜分界清楚； 可大量繁殖，镜下可见分裂期细胞； 肉眼可见在培养瓶中可沉底，轻轻晃动后均匀分布；培养基清亮。 培养生长不好时，聚集成团的细胞少，生长慢，细胞有皱缩、破碎、透光性降低等现象。,微生物污染,传代或换液后24h48h可观察到； 细菌、真菌污染的典型表现：培养液混浊，液体内漂浮有菌丝或细菌； 支原体污染：不明显，细胞生长明显变缓，胞质内颗粒增多，有中毒表现，但培养液多不发生混浊。,细胞冻存与复苏,细胞冻存（缓慢） 细胞复苏（快速）,冻存和复苏的原则：慢冻快融,细胞冻存和复
7、苏,优点：细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,细胞冻存方法,配制冻存液： 20%血清培养基10% DMSO DMSO溶解要产热，应提前配，避免伤细胞。 DMSO的作用 收集对数生长期细胞，加入适量冻存液, 用吸管吹打成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml) 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻批号。,慢冻程序,原则：当温度在-25 以上时， 12 /min；当温度达-25 以下时， 510 /min；当温度达-100时，可迅速放入液氮中。 GMP程序： 将冷冻管（管口朝上）放入纱布袋内， 4
8、冰箱0.5h；20冰箱0.5h；70冰箱0.5h；转入液氮。 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。,细胞复苏方法,（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。 （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 （3）低速离心5分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。,结语,细胞培养是一件繁琐、细致的实验！需要实验者具有缜密的思维及足够的耐心！ 谢谢聆听，共同学习！,
