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1、第八章 现代生物技术在抗生素工业中的应用 周浓副教授 重庆三峡学院生命科学与工程学院,抗生素、氨基酸、核苷酸、维生素等,基因工程药物、疫苗及抗体产品,传统生物制药,现代生物制药,传统生物制药工业的特点,产量与发酵规模大 出口比重大 示范效应明显,产业规模大,2007年我国抗生素原料销售收入350多亿元，我国抗生素原料药产能、产量居世界首位 产能过万吨产品：青霉素、头孢菌素、红霉素 中国已经成为氨基酸生产和消费大国, 年消费量约 140 万t左右 维生素现已成为国际医药与保健品市场的主要大宗产品之一，每年维生素市值已达25亿美元，我国年产能力约20万t,大容积发酵罐,传统育种方法与现代生物技术
2、在制药工业中的比较,传统的育种方法: 要用经典的方法育种 盲目性高 不能组合不同菌株的优良性状,现代生物技术: 基因重组改造菌种 提高产品产量 改造传统的发酵生产工艺,节约能源和原料,降低污染,诱变育种,采用诱变因子促使微生物遗传物质发生改变，从而导致其性能改善到菌种优化方法 物理诱变因子 紫外线、射线 化学诱变剂 化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等,突变是随机过程，筛选过程大，不能增加拷贝数,现代生物技术：理性化育种,建立在微生物生理代谢理论和抗生素合成机理基础上，有目的调节产生菌生理代谢、调节生物合成途径或改造其生物合成基因结构到育种。 链霉菌为主到次级代谢产物产生菌到基因克隆表达
3、宿主系统日益完善,新观点：系统代谢工程改造菌种,Park JH, et al. Current Opinion in Biotechnology,2008,19:454-460,System Metabolic Engineering,大量引进国外高产菌株,我国至今用于大规摸工业生产的生产菌株，如青霉素、红霉素、头C、各种氨基酸、阿维霉素、泰乐霉素、黄霉素以及高表达水平的基因工程产品等几乎都是从国外高价引进。因此，从根本意义上来说，我国的传统生物制药工业和现代生物技术产业缺乏竞争力。,现代生物技术改造传统制药工业,抗生素 提高产量和改善组分 产生新的杂合抗生素,Olano C et al. M
4、etabolic Engineering 2008,10:281-292.,红霉素全基因组序列,现代生物技术改造传统制药工业,氨基酸 获得高产菌种 缬氨酸 组氨酸 苏氨酸 异亮氨酸,缬氨酸高产菌种代谢工程改造,现代生物技术改造传统制药工业,维生素: 获得高产菌种 简化生产工艺,维生素C 我国发明了维生素C两步发酵法，使中国维生素C生产技术居世界先进水平 维生素C产量5万吨以上，占全球产量的40%,背 景,20世纪70年代,重组DNA技术兴起应用于医药蛋白多肽方面,取得了突出的效果. 80年代,重组DNA技术应用于结构比较复杂的次级代谢产物的生物合成.(链霉菌) 目前,抗生素生物合成酶基因的分离
5、 ,质粒的选择,基因重组于转移和宿主表达.(已克隆的抗生素合成基因有23种之多),基因工程在抗生素生产中的应用,第一节 重组DNA技术在抗生素生产中的应用,重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。,抗生素生物合成并非单一基因的直接产物，而是由初级代谢产物经过一系列酶催化产生的次级代谢产物，其形成过程是一个复杂的、多因素调节的过程 传统的提高微生物产生抗生素能力的方法主要是用诱变剂（如紫外线
6、、化学诱变剂等）处理微生物，获得生产能力较高的突变株。80年代，人们开始将DNA重组技术应用于次级代谢产物的生物合成上；通过生物合成酶基因的分离、质粒的选择、基因重组与转移、宿主表达等方面。,传统发酵法的弊端：采用经典方法育种，盲目性高，无法集合不同菌株的优良性状。基因重组技术的优点：可以定向改造菌种，且能集多个菌株的多种优良性状于同一菌株，达到简化工艺、提高产品质量和产量的目的。,一、克隆抗生素生物合成基因的方法,1.抗生素（链霉素）生物合成基因的结构特点 链霉菌抗生素生物合成基因组的一个典型特性是G-C碱基组成， （G+C）%高达70%以上；且三联体密码子中第3个碱基G、C比例极高 抗生素
7、生物合成基因大多处于一个基因族中 抗生素生物合成基因除定位在染色体上外，有的定位于质粒上,2.克隆抗生素生物合成基因的方法,1）阻断变株法 2）突变克隆法 3）直接克隆法 4）克隆抗生素抗性基因法 5）寡核苷酸探针法 6）同源基因杂交法 7）在标准宿主系统中克隆检测单基因产物,1.阻断变株法,阻断变株法 通过一系列阻断变株的互补结果来确定被克隆的DNA片断的性质 方法与步骤 野生型 突变型 筛选表型恢复型 分析基因 总DNA 基因库,Tetracenomycin C (tam C),Tetracenomycin C(丁省霉素) 是一个有淡青链霉菌产生的抗生素 分离tamC的突变株 并 分析阻断
8、性质 野生型总DNA BamH1消化 连接到pIJ702,分离tamC+,克隆其基因,2.突变克隆法,3.直接克隆法,直接克隆法 直接克隆整套的生物合成基因（适合于基因簇相对较小（30kb）的抗生素生物合成基因。 局限：大片段基因簇的稳定性、原始株的重要的调控因素,头霉素C基因的克隆,根据抗生素生物合成基因和抗性基因是连锁的，表达上也是协同的，而且抗性基因比较小（1-2kb），容易检测和克隆。,局限：有些抗生素不与合成基因连锁，并且可能抗性不止一个，所以分析比较复杂。,4.克隆抗生素抗性基因法,红霉素生物合成基因的克隆,5.寡核苷酸探针法,事实基础 链霉菌基因对密码子的利用有明显的不随机性，即
9、DNA中G+C的比例为70%以上，密码子第三位有90%以上为G或C 原理 分离抗生素生物合成酶后，获得这些酶的氨基酸序列，根据氨基酸序列推倒出较低程度简并性的基因序列，人工合成寡核苷酸探针，从基因文库中就可克隆生物合成基因,6.同源基因杂交法,原理 利用一种已克隆的抗生素生物合成基因片段为探针，探测相关抗生素同源基因，最后分离及克隆抗生素生物合成基因 由于基因保守序列的同源性，利用同源基因杂交法克隆化学结构类似的抗生素生物合成基因是比较快速准确的方法,7.在标准宿主系统中克隆检测单基因产物,鸟枪克隆法 把抗生素产生菌的DNA克隆到最常用的宿主变青链霉菌中，通过检测宿主中的个别基因产物，筛选克隆
10、，从而分离基因。 利用鸟枪克隆法，把抗生素产生菌DNA克隆到最常用的宿主变青链霉菌中，通过检测宿主菌中个别基因产物，筛选克隆，从而分离到相应的基因。,抗生素基因簇的组成,PABA合成酶基因pab的克隆,受体菌,克隆抗生素所用的方法,二、几种典型的抗生素生物合成基因的结构,红霉素:参与红霉素生物合成的基因长度为60kb，整个基因由23个ORF(open reading frame)组成。中心部分约为35kb，称为eryA，由3个ORF（ eryA ， eryA ， eryA ）组成，主要参与内酯环的合成。eryF编码细胞色素P450单氧化酶，使6位原子羟基化；”eryB ”与”eryC ”是两组
11、基因，分别与红霉素的形成和红霉内酯的3-O-红霉糖苷化有关，及与红霉糖胺的形成或3-O-红霉糖苷化有关； eryK编码C-12羟基化酶。,AT-acyltransferase ACP-acyl carrier protein KS-ketosynthase KR-ketoreductase DH-dehydrtase ER-enoylreductase TE-thioesteras,脱氧红霉内酯B,脱氧红霉内酯B的生物合成,ORF1,ORF2,ORF3,青霉素：pcbC基因编码异青霉素N合成酶，通过“反向遗传学”方法克隆IPNS的N末端氨基酸序列，根据已知的氨基酸序列，以合成的寡核苷酸为探针，
12、通过杂交来识别含有相关DNA序列的克隆体，经DNA序列分析发现了一个可读框，并能在大肠杆菌中表达，这种重组大肠杆菌可产生IPNS，故证实已克隆到了pcbC基因。,按硫代模板机制进行。ACV合酶合成-氨基己二酸-半胱氨酸-D-缬氨酸三肽。由IPN合酶催化形成异青霉素N。,+,+,ACV合酶,异青霉素N,IPN合酶,-氨基己二酸-半胱氨酸-D-缬氨酸三肽,异青霉素的生物合成,青霉素和头孢菌素的生物合成,三、提高抗生素产量的方法,经典方法 通过物理或化学手段进行诱变育种得到高产菌株,基因工程方法 定向改造基因 提高基因的表达水平 改造菌种生产能力,提高抗生素产量,在工业上改良微生物工业菌种，提高抗生
13、素产量主要依赖物理化学手段进行诱变育种，但是利用基因工程手段有目的地定向改造基因，提高基因表达，以及改造菌种生产能力具有极大发展潜力。,原理：在克隆菌株中，增加某一与产量有关的基因（限速阶段的基因或正调节基因）剂量，使产量提高。,方法1：将产生菌基因随机克隆至原株直接筛选高产菌株,抗生素合成途径中的某个阶段可能是整个合成中的限速阶段，识别位于合成途径中的“限速瓶颈”，并设法倒入能提高这个阶段酶系的基因拷贝数，就有可能增加最终抗生素的产量。故增加生物合成中限速阶段酶基因剂量有可能提高抗生素产量。 抗生素合成途径中的代谢支路的关键基因消除，提高红霉素合成流量,方法2：增加和敲除合成途径的关键基因,
14、增加生物合成限速酶系编码基因的拷贝数,Methylmalonyl-CoA (mmCoA) metabolite node in erythromycin biosynthesis,开源：强化红霉素合成甲基丙二酰CoA代谢节点,拷贝甲基丙二酰CoA变位酶（MCM）操纵子，红霉素产量增加50%。,Reeves AR, et al. Metabolic Engineering,2007,9: 293-303.,节流：克拉维酸合成中3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因敲除,Li RF et al. Metabolic Engineering, 2006,8: 240-252.,依据 在许多链霉菌中，调节基因嵌
15、在控制抗生素产生的基因簇中 正调节基因对结构基因进行正向调节 负调节基因对结构基因进行负向调节 将额外的正调节基因引入野生型菌株中，使获得高产产物的最简单的方法 增加正性调节基因或降低负性调节基因也是增加抗生素产量的方法,方法3：通过调节基因的作用,红霉素合成调节基因bldD的发现,Chng C, et al. PNAS,2008,105:11346-11351,美伐他汀合成调节基因mlcR的强化表达,降血脂药物,Appl Microbiol Biotechnol (2009)83:697704,事实依据 1、抗生素的生产水平是由抗生素生物合成酶和对自身抗性的酶所共同决定的 2、抗性基因经常和
16、生物合成基因连锁，是激活生物合成基因基因转录的必需成分 3、抗性基因必需先转录，建立抗性后，生物合成基因的转录才能进行 所以可以通过提高菌种自身的抗性水平来改良菌种，提高抗生素产量。,方法4：增加抗性基因,链霉素抗性筛选法在选育博来霉素A2组分高产菌株中的应用,中国医药工业杂志,2007, 38(5): 344-346,四、改善抗生素组分,例: 阿维菌素 选育只能生产B2a的菌株是十分有意义的,基因工程在抗生素生产中的应用,多组分，生理活性上，相差大。应用基因工程方法，可以定向的改造抗生素产生菌，获得只产生有效组分的菌种。,红霉素基因工程技术 现状,次级代谢产物的复杂代谢调控机制 分子改造局限于模式生物，缺乏工业生产菌株的应用，国内外没有报道,红霉素生物合成途径,7264个基因，多基因簇,原生产菌株HPLC组分图,红霉素生物合成途径的复杂性,1 丙酸 6 甲基丙二酸,PKS,ery A,6-脱氧红霉内酯 （6-dEB）,ery F,C
