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1、,血小板血型相容性试验检测技术,苏 凯,长春博德生物技术有限责任公司 2010-9-24,血小板简介,血小板：D:25m V:红细胞*1/5 功能：促进止血和加速凝血 维持毛细血管壁完整性 正常范围：100-300109/L,骨髓干细胞,多功能祖细胞,巨核祖细胞,巨核细胞,幼巨核细胞,血小板,胞质块脱落,产生：,血小板抗原,共有抗原,HLA抗原 ABH抗原 其它抗原,特异性抗原（HPA抗原）,血小板具有HLA-类抗原（HLA-A、HLA-B抗原 和少量HLA-C抗原），无HLA-类抗原。故输 注血小板要比器官移植所需配型简单。 HLA-类分子为血小板的固有蛋白，少量从血 浆中吸附。,HLA 抗
2、原,部分为血小板的固有蛋白，另一部分从血浆中 吸附。 血小板上的ABH抗原个体之间表达不同，5%- 10%的非O型个体为A抗原或B抗原的高表达者。 故血小板输血应同型输注；抗体检测应采用O 型血小板。,ABH 抗原,Ii, Lea,Leb ,P2,其它共有抗原,主要存在于血小板膜的GP分子上，也少量存在于 血管内皮细胞、结缔组织细胞和平滑肌细胞。 1990年国际输血协会血小板免疫学工作组提出了 HPA命名，以发现的时间顺序排列：HPA-1、HPA- 2、HPA-3等系统，每一系统中高频率基因表达的 抗原以a表示，低频率基因表达的抗原以b表示， 新发现的系统以w表示。,血小板特异性抗原（HPA抗
3、原）,已确定了24个HPA，其中12 个抗原为双等位基因 表达（HPA-1,-2,-3,-4，-5和-15），且呈共显 性表达模式。 单核苷酸多态性（SNP）:24个HPA中有22个已搞 清楚基因背景，其中21个HPA的多态性型是由一 个氨基酸置换所致，而这又是由编码血小板膜糖 蛋白（GP）基因的一个核苷酸的不同所致。 HPA-14bw不具有单核苷酸多态性。其核苷酸置换 发生在1909-1911delAAG。,血小板特异性抗原（HPA抗原）,血小板特异性抗原,血小板血型与临床,血小板抗原 同种异体抗原 HLA-I,HPA,ABH 同种抗原 GPb/a,CD36 自身抗原 GPb/a,GPb/
4、药物依赖性抗原 肝素、奎宁等 非特异性抗原,血小板免疫性疾病 血小板输注无效症 新生儿血小板减少症 输血后紫癜 自身免疫性血小板减少症 药物引起的血小板减少症 移植相关的血小板减少症,临床病症 淤点 淤斑 流产 （颅内）出血 死亡,血小板血型与临床-同种异体抗原,输血,妊娠,骨髓移植,致敏血小板并引起破坏,抗供者 血小板抗体,抗父亲 血小板抗体,抗供者 血小板抗体,出血/紫癜,流产/死胎,移植排斥,血小板,血小板血型与临床-药物性抗原,Pl,血小板减少,出血,免疫性血小板减少症,患者,药物依赖性抗体,药物,？,外源血小板,同种/同种异体抗体,Pl,患者血小板,药物,患者血小板,Pl,外源血小板
5、,血小板被清除,自身抗体,血小板输血必要性,轻度血小板减少症患者 血小板计数50109/L，会出现凝血障碍，导致出血不止，特别对于严重失血患者、产妇等。 严重血小板减少症患者 血小板计数10109/L，会出现自发出血、颅内出血甚至死亡，特别对于白血病、肿瘤化疗、骨髓异常综合症及ITP患者等。,血小板输血是提高患者（特别是肿瘤和移植患者）血小板计数，防止出血最为快速、有效的方法和手段。 然而，血小板输血并不是每次都能达到满意效果，特别是反复多次随机输注血小板的患者，体内极易产生血小板抗体，从而破坏输入的血小板并引起输注无效。 文献报道约有2050白血病患者，80的再生障碍性贫血患者长期随机输注血
6、小板后会出现输注无效状态，导致患者因血小板计数低下而自发出血或出血不止，甚至死亡。 我国目前大多数临床单位采用随机输注血小板，导致血小板输注无效频繁发生。 后果：患者病情得不到改善，病危甚至死亡；浪费财力、物力；浪费宝贵的血小板资源；不利于血站及输血科业务水平的提高。,血小板输血？,非免疫性 血小板本身质量。 患者情况：发热感染、脾肿大、弥散性血管内凝血（DIC）及药物作用 。 免疫性 同种异体免疫作用：HLA-类抗体（80%）、HPA抗体、ABO血型抗体。 自身免疫作用：ITP患者。 药物免疫作用：肝素、奎宁、头孢菌素、苯巴比妥、消炎痛、安替比林等,血小板输注无效的原因,血小板输注无效的预防
7、,输注质量可靠的ABO同型血小板制剂 减少患者接触同种异体血小板抗原的机会 去除白细胞的血小板制剂 紫外线照射的血小板制剂 去除HLA抗原的血小板制剂,供者选择 选择与患者ABO血型相同的供者血小板。 RhD阴性患者应当尽可能输注RhD阴性供者血小板。 选择与患者HLA相容的供者血小板 HLA配合试验（HLA-matching） 抗体特异性预测试验（ASP） 交叉配型试验（cross matching） 静脉注射免疫球蛋白（IVIG） 血浆置换 免疫抑制剂 抗纤溶药物,血小板输注无效的处理,血小板抗体与部分相关疾病,血小板相容性检测,采取预防和治疗措施 避免流产、出血等,减少血小板输注无效 避
8、免紫癜、出血和死亡,血小板相容性检测,抗原定型,抗体检测,交叉配型,建立血小板供者库,筛选基因型相容的供者 避免血小板抗体的产生,诊断血小板免疫性疾病,筛查血小板相容性供者,血小板抗原定型,血清学定型 即用已知特异性抗体检测血小板血型抗原 缺点：特异性抗体来源困难 -人血清中血小板抗体通常为多特异性 -单克隆抗体匮乏，目前国际上仅有HPA-1a单抗， 无其它HPA单抗。 基因定型 限制性片段长度多态性分析（RFLP） 序列特异性寡核苷酸聚合酶链反应(PCR-SSO) 序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP),血小板抗原定型（PCR-SSP）,用途： （1）健康人群HPA基因分型，建立已知H
9、PA基因型的血小板献血员库。 （2）检测受者HPA基因型，以便从血小板献血员库中寻找与其HPA基因型相 匹配的血小板供者。 （3）检测患者HPA基因型，辅助临床胎儿/新生儿免疫性血小板减少症、输 血后紫癜及血小板输注无效症等疾病的病因诊断。 （4）对特定区域或种族人群HPA基因分型，可为人类遗传学研究提供相关 资料和证据。,血小板抗体检测方法,方法,指标,血小板抗体检测方法-固相凝集法,抗人IgG,血小板抗体筛检，包括HLA抗体、HPA抗体及其它血小板反应性抗体。辅助血小板相关免疫性疾病的诊断。 血小板交叉配型，为患者筛选相容性的血小板或血小板供者，避免血小板输注无效症的发生。 患者自身抗体检
10、测，包括血小板结合抗体和血清中游离抗体。检测血小板结合抗体可将患者血小板平铺在反应孔后，直接加入抗人IgG和指示红细胞进行检测。血清中的游离抗体可通过患者自身血小板和血清反应来检测。,用途：,血小板抗体检测方法-固相凝集法,血小板抗体检测方法-固相凝集法,（一）同种/同种异体抗体检测,血小板抗体检测方法-固相凝集法,抗原：三人份等比例混合O型血小板悬液： 1.将有效期内机采血小板用生理盐水进行5-10倍稀释后混合； 2.采血8小时内EDTA/枸橼酸钠抗凝全血经200g离心10分钟，取 上层2/3PRP混合。 3.冻干血小板用生理盐水稀释后直接使用。 意义：检测血小板减少患者，妊娠、移植及待输血
11、等患者体内 是否存在血小板抗体。若抗体阳性，应坚持进行交叉配型以输 注相容或相合的血小板，提高输血效果。,血小板抗体检测方法-固相凝集法,抗原：患者自身血小板(因ITP患者体内血小板数量较低，因此试验前需将调节血小板浓度至50-100109/L）。 意义：自身免疫性血小板减少症(ITP)是一类由自身抗体导致血小板破坏增多的出血性疾病。多数学者认为与体液免疫有关，机体对血小板相关抗原发生免疫反应，产生抗血小板抗体，抗体致敏的血小板由单核巨噬细胞系统迅速清除而发病，且骨髓巨核细胞有成熟障碍。ITP的诊断目前仍依赖临床表现和骨髓检查，并以排除血小板减少的其它原因为基础，因此，急需特异性强的实验室诊断
12、方法和诊断指标。检测血小板自身抗体已成为ITP诊断的一个重要指标。,（二）自身抗体检测,血小板抗体检测方法-固相凝集法,直接法：自身结合抗体检测,血小板抗体检测方法-固相凝集法,间接法：自身游离抗体检测,血小板抗体检测方法-固相凝集法,（三）药物依赖性抗体检测,注：洗涤液中同样需加入100U/ml的待检药物。,抗原：三人份等比例混合O型血小板悬液： 1.将有效期内机采血小板用生理盐水进行5-10倍稀释后混合； 2.采血8小时内EDTA/枸橼酸钠抗凝全血经200g离心10分钟，取 上层2/3PRP混合。 3.冻干血小板用生理盐水稀释后直接使用。 意义：根据患者服用/输注的药物不同而在试验中加入相
13、应的药 物，以确定患者体内是否已产生药物依赖性血小板抗体，辅助 临床诊断以及采取适当的护理措施。,血小板抗体检测方法-固相凝集法,血小板抗体检测方法-固相凝集法,（四）交叉配型,抗原：与受者ABO同型的供者血小板悬液： 1.将有效期内机采血小板用生理盐水进行5-10倍稀释； 2.采血8小时内EDTA/枸橼酸钠抗凝全血经200g离心10分钟， 取上层2/3PRP。 意义：为血小板输血患者提供相容性血小板，减少输注无效 症的发生，为社会节约宝贵的血小板资源。,血小板抗体检测方法-固相凝集法,抗体检测：三人份O型 血小板。 交叉配型：献血者血小板,EDTA或枸橼酸钠抗凝全血：200g离心10min
14、机采血小板：生理盐水5-10倍稀释。,血清或血浆样本，充分离心后检测。,血小板抗体检测方法-固相凝集法,1.血小板分散均匀，未发生聚集是本实验成功的关键之一。陈旧或已发生聚集的血小板容易导致假阳性结果，特别注意不能将血小板放置于4冰箱中。血小板悬液的浓度不合适会影响试验结果，浓度过低（小于10109/l）或太高（高于350109/l）都会导致错误结果。 2.待检的血清或血浆样本检测前应充分离心以去除颗粒及聚集物，否则可能会出现假阳性结果。肝素抗凝样本不能用于本实验。待检样本脂类含量高或微生物污染会造成假阳性；纤维蛋白原未充分析出的血清样本会导致错误结果。 3.洗涤过程中须滴加洗液，水流剧烈冲击
15、会造成血小板单层的破坏而导致错误结果。 4.献血者与受血者ABO血型不相容或自身IgG抗体结合到供血者血小板上易引起假阳性结果。 5.离心力和离心转数的换算公式为：Rcf(g)=1.119105r(rpm)2(r单位为cm)。离心时间及速度不合适，血小板和微孔板结合差，可能会减少最终实验结果的敏感性和反应强度。,注意事项：,血小板抗体检测方法-固相凝集法,优点：,不仅快速简便，结果直观可靠，而且其敏感性和特异性和免疫荧光法相一致，同时，采用完整血小板作为抗原进行检测特别适合于血小板交叉配型。第15版AABB（American Association of Blood Banks）手册称赞该方法
16、“is the most widely used method for platelet crossmatching, and test results are reasonably predictive of posttransfusion platelet counts”。 应用冻干型血小板进行抗体筛检，方便临床应用，且易于标准化。 血清或血浆样本均可，实验无需特殊仪器且1小时内完成检测，适合于快速血小板抗体检测和交叉配型。,血小板抗体检测方法-固相凝集法,冻干型血小板抗体筛检细胞,通过间接ELISA法采用特异性单克隆抗体检测血小板抗体筛检细胞冻干前后糖蛋白b/a、a/a、b/、的抗原性变化是否显著，同时用无关单抗作为对照。以P/N值（特异性糖蛋白单抗检测值/无关单抗检测值）作为衡量抗原性的指标绘制柱形图，结果表明血小板冻干前
