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1、,甲胎蛋白检测实验,2016年12月28日,实验步骤,实验目的,实验原理,1.判断该方法检测甲胎蛋白的难易程度。 2.实验该方法是否便于作为临床检测甲胎蛋白使用。,实验目的,实验原理,原理,与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是 聚丙烯酰胺凝胶电泳 被检测物是蛋白质 “探针”是抗体 “显色”用标记的二抗。,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)和催化剂(AP)、加速剂(TEMED聚合成的三维网孔结构(凝胶）。据有无浓缩效应可将电泳分为两类： (1)连续系统：缓冲液pH值、凝胶浓度相同，带电粒子靠电荷及分子筛效应区
2、分。 (2)不连续系统：缓冲离子成分、 pH值、凝胶浓度不同，带电粒子在电场中由电效应、 分子筛效应、浓缩效应区分。 SDS-PAGE的原理是：依靠SDS带有大量负电荷来掩盖蛋白质表面的净电荷：同时由于在电泳溶液中加入了SDS和巯基乙醇，因此它还可以改变蛋白质构象：,原理,原理,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。,技术流程,实验步骤,(一)蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳,1.制胶,（1）将配制好的分离胶液倒入两块玻璃板之间的凝胶室中，待胶液加至距短玻璃板 顶端约1.5c
3、m处时停止灌胶，然后在胶液表面上小心加入厚约0.5cm的水层 （2）待凝胶和水之间出现清晰界面时，说明分离胶已聚合 ，大约30min完成聚合。倾去分离胶上层的水，将配制好的浓缩胶液加到分离胶上，至接近短玻璃板的顶端 ，插上样品梳，放置待其聚合。,30丙烯酰胺贮备液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水至100ml。 浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8。 分离胶缓冲液：3mol/L Tris-HCl，pH8.9。 10过硫酸铵：临用前用蒸馏水配制。 10SDS 10TEMED 封闭液及抗体稀释液：5脱脂奶粉-TBS，每组配10ml。 底物溶液：2.5
4、mg二氨基联苯胺（DAB）+ 10mlTBS +10l H2O2，临用前配制。,电极缓冲液：甘氨酸 11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g, 加水至800ml，pH8.3。 样品缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH6.8，20甘油，4SDS，10巯基乙醇，0.005溴酚兰。 TBS（Tris-HCl,NaCl）缓冲液： 20mmol/L Tris-HCl,500mmol/L NaCl，pH7.5，每组配150ml。 TBST：取100mlTBS，加250l 20Tween-20。,材料及常用试剂,(二)蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体,1.放置NC
5、膜和胶条： .切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用甲醇浸泡15s,水2min,再浸入转移缓冲液中。 .准备2张滤纸和海绵一起浸泡在转移缓冲液中。 打开转移转移槽的胶板，依次放入：a.一张浸湿的海绵 b. 一张浸湿的滤纸c. 用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的气泡d. 硝酸纤维素膜，在膜的右下角剪一小角，以标明电泳方向e. 一张浸湿的滤纸f. 一张浸湿的海绵。,2.配制电极缓冲液：甘氨酸 14.1g，SDS 0.5g，Tris 3g，加水至1000ml，pH8.3。每组配1000ml。 3.制 样：5l人血清，加45l水，再加50l加样缓冲液。沸水浴加热8分钟，10000rpm离心
6、2分钟,取上清液作为样品。另按说明书制备好蛋白质分子量标准样品。 4.加 样： （1）加入电极缓冲液，拔出胶的样品梳； （2）选3个样品槽，用微量进样器加样，中间槽加入5l分子量标准蛋白样品，两旁槽各加入10l人血清样品。 5.电泳 稳压120V/200V电泳，当溴酚蓝前沿到达距底部0.5cm左右时，停止电泳。,(二)蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体,按胶侧为负极，膜侧为正极的方向放入转移电泳槽中，加转移缓冲液至满。插好转移电泳装置的电极，打开电泳仪开关调至稳压130V，电转1h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。,(三)对固定于硝酸纤维素滤膜上的甲胎蛋白进行染色,1.封闭：加
7、封闭液1ml，37摇床上摇动1h. （1）与第一抗体结合 弃封闭液，加入适当稀释的1ml第一抗体溶液，封口后37摇床上轻轻摇动2h。取出膜，用TBST洗膜3次，每次5min。再封入一新的塑料薄膜袋内。 （2）与酶标第二抗体结合 加入适当稀释的1ml辣根过氧化物酶标记，37摇床上轻轻摇动1h。取出膜，用TBST洗3次，每次5min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。 2. 加底物溶液显色 将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。转入水中保存。,辣根过氧化物酶最敏感的底物是3,3-二氨基联苯胺，它在过氧化物酶所在部位转变成棕色沉淀。在钴或镍离子存在下进行
8、反应可以加深沉淀的颜色并提高反应的灵敏度。但是，使用辣根过氧化物酶不可能完全排除背景颜色，因此须十分小心地观察生色反应，一旦特异性染色蛋白带清晰可见，就应尽快终止生色反应。,（四）化学发光、显影、定影,1.将超敏型ECL试剂倒在保鲜膜上；1 min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1 min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。 2. 在暗室中，将1份显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1 cm）；打开X-光片夹，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1 min或5 min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为12 min（2025），温度过低时（低于16）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为510 min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。,结果与分析,若X光片上存在大量显色结果，则可说明该血清提供者体内存在甲胎蛋白。 若仅有微量或无显色，则认为甲胎蛋白检测成阴性。,结果分析,
