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1、基于流式细胞术的单细胞分析 在临床及科研中的应用,台州市中心医院医学检验科,陈琪,(一) 流式细胞术的概念 流式细胞术(flow cytometry,FCM)是利用流式细胞仪对生物颗粒包括细胞(红细胞、白细胞、各类组织细胞、血小板等)、微生物以及人工合成微球的多种物理和生物学特性进行定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的细胞参量分析技术。,一、流式细胞术的基本原理,(二) FCM的工作原理 1.荧光染色 (1) 用荧光染料直接染色，如：PI (2) 用荧光抗体间接染色，FITC,PE 2.液流技术：细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液的约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞悬液。 3.激光技术： 散射光信
2、号 (FS、SS) 荧光信号 (FL1、FL2、FL3、FL4) 4.数据处理,Flow Cell,Laser,Fluorescence Detectors,PMT,PMT,PMT,PMT 4,Dichroic,Filters,Bandpass,Filters,Flow Cytometry Principle,Laser,1,2,3,4,Flow cell,525BP,575BP,620BP,675BP,流式细胞仪检测平台的独特之处,单细胞为检测单位 速度快 （100000细胞/秒） 灵敏度高（具有1/10000） 多色标记-多种信息 能够同时检测细胞表型，功能，蛋白表达，磷酸化现象等，是细胞
3、研究中唯一可以多角度，深层次剖析细胞的工具,特异、灵敏、多元化、高速、客观、省时,肿瘤学应用（1）-DNA及细胞周期分析,DNA含量测定 解析细胞周期 细胞增殖动力学变化,早期诊断 探讨化疗药物的作用机制，化疗药物选择 放疗强度、时间决定 评估疗效 判断预后和转移,肿瘤学应用（2）-膜抗原分析,造血系统肿瘤的分型 肿瘤基因表达产物 多药耐药性基因的表达产物 肿瘤相关抗原 激素受体 淋巴细胞亚群 其它与癌细胞生物行为有关因子,肿瘤学应用（3）细胞凋亡分析,DNA单染色，发现细胞凋亡峰（Ap峰， Apoptosis），坏死及其它原因引起的细胞碎片形成不规则的峰形，位于Ap峰与G1峰之间。 Anne
4、xin V荧光标记，与磷酯酰丝氨酸（细胞凋亡早期从膜内暴露到膜外）结合，FCM检测。 多色分析，荧光探针标记DNA和蛋白质。,肿瘤的临床应用,细胞周期和倍体分析 淋巴细胞及其亚群 白血病免疫分型及残留,DNA细胞周期分析与临床应用,细胞周期,0,200,400,600,800,1000,s,DNA分析,DNA含量,细胞数量,利用特殊的荧光染料与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。 流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量，解析细胞周期。,细胞DNA分析原理,DNA检测常用荧光染料,355nm或375nm： Hoechst
5、33342、 DAPI、 DyeCycle Violet 488nm：PI、7-AAD、DyeCycle Green 、 DyeCycle Orange、 633nm：DRAQ5,- FCM在肿瘤学中的应用主要是DNA和抗体标记 - DNA标记主要是488nm激发的PI -抗体标记则主要是488nm激发的FITC、PE、PC5、PC7等染料,DNA细胞周期分析参数,DNA倍体性Ploidy 细胞内染色体DNA含量 二倍体Diploid 正常体细胞内染色体DNA含量 DNA指数（DI） 测定标本的G0/G1期细胞DNA含量 与同种系正常细胞的G0/G1期细胞 DNA含量的比值，表示细胞倍体性 S
6、期含量SPF S期细胞占总周期细胞的比例 CV G0/G1期细胞DNA含量变异系数,DNA的倍体和DNA指数的关系,FCM在肿瘤学中的应用-血液标本,肿瘤患者的免疫功能检查 肿瘤患者的粘附分子检查 ICAM-1 CD54 ICAM-2 CD102 ICAM-3 CD106,FCM在肿瘤学中的应用-脱落细胞,DNA分析,尿液 宫颈分泌物 胸腹水 肺泡灌洗液 各种刺激液 食道镜钳取的活检组织 支气管镜钳取的活检组织等,倍体检测,转移性癌 良性反应性增生,赵XX 淋巴结细针穿刺 DNA出现异陪体，CD45阴性，几乎所有标记都是阴性（转移性癌）,颜XX 淋巴结细针穿刺 非霍奇金淋巴瘤（弥漫大B细胞型）
7、 Ann Arbor分期IIIA期、IPI评分高危组,DNA含量的表示,细胞群的DNA含量在FCM中一般以DNA指数（DNA index，DI)表示相对含量，一个正常的二倍体细胞峰，其G0/G1期细胞DNA含量为2C，DI值为1.0。 DI=（样本G0/G1期细胞峰平均荧光道数）/（正常二倍体标准细胞G0/G1期细胞峰平均荧光道数）,对于一个正常人体的二倍体细胞群，G0/G1期占85-90%以上，S+G2M细胞占10-15%以下。,王XX 超声内镜下胆总管下段刷检涂片（病理诊断：见癌细胞，倾向腺癌）,周XX 肺泡灌洗液 （右上肺腺癌大小1.8*1.0cm),费XX 尿液 病理高度可疑癌细胞（左
8、肾盂尿路上皮癌，低分化,大小3cm3cm），,蒋XX 淋巴结 （右肺癌伴颈部淋巴结，肝内转移,可能为大细胞神经内分泌癌或分化差癌伴神经内分泌分化）,王XX 腹水 （ 妇科腹膜间皮瘤）,手术切除的乳腺肿块,DNA细胞周期分析临床意义,DNA诊断肿瘤 DNA非整倍体细胞峰或突出的四倍体细胞峰 S期细胞含量10-15% DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 在淋巴瘤病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待 形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标,DNA细胞周期分析临床意义,DNA及倍
9、体分析在某些肿瘤有预后价值： 膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、皮肤黑色素瘤 非整倍体的肿瘤恶性程度高，复发率高，转移率预后差。 近二倍体和二倍体肿瘤预后好，少数肿瘤的DNA分析对预后无判断价值。高S期肿瘤一般比低S期对化疗敏感。 S期比率与肿瘤组织学分级密切相关： 肺癌、乳腺癌、Hodgkin、卵巢癌、直肠癌、甲状腺癌、睾丸癌、脑型星形细胞瘤,DNA细胞周期分析临床意义,监测病情与药效： 流式细胞术可精确检测药物对肿瘤细胞的作用，研究肿瘤化疗药物的选择，制定合理的化疗方案，并随时监测病情发展和治疗效果，判断临床治疗方法的疗效或用于探讨新药新方法的作用机理和疗效。 脱落细胞DNA分析: 细
10、胞抽吸物、体液、组织液、灌洗液脱落细胞的DNA分析。,肿瘤细胞SPF(S期含量),肿瘤细胞(单克隆) (14.18%),正常骨髓细胞 (2.93%),肿瘤细胞(多克隆) (28.52%),免疫功能检测,淋巴细胞亚群分析,激活T淋巴细胞: CD3+CD25+ CD3+HLA-DR+ CD3+CD69+ 诱导性T淋巴细胞： CD3+CD4+CD45RA+ 抑制性T淋巴细胞： CD3+CD8+CD28- 细胞毒性T淋巴细胞：CD3+CD8+CD28+ 记忆T淋巴细胞： CD3+CD4+CD45RA-CD45RO+ 未活化T淋巴细胞：CD3+CD4+CD45RA+CD45RO-,淋巴细胞亚群分析,流式
11、蛋白定量技术的应用 （Application of Cytometric Bead Array ）,正常人体内的Th1类细胞因子（IFN-、TNF-、IL-2）与Th2类细胞因子（IL-10、 IL-5、 IL-4）保持着相对的平衡。当这种平衡被打破也预示着疾病的发生，肿瘤的发生也伴随着Th1/Th2的转归与变化。由于细胞因子功能的多效性与细胞因子之间存在相互影响与转化，单个细胞因子的变化难以清楚的判断与肿瘤发生发展的关系，Th1 /Th2的分类使肿瘤细胞免疫学的概念清晰化，近年来研究Th1/Th2两类细胞因子的漂移方向逐渐成为热点。,Th1/Th2漂移,CBA简介,Cytometric Be
12、ad Array 单个样本，同时定量液相中多种蛋白浓度 抗原抗体反应原理 基于流式细胞仪平台,一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，与待测样 本孵育后，形成“三明治”复合物。,Capture Bead,Capture Ab,Bead,+,+,Analyte of interest,Fluorescent detection Ab,1,2,3,不同强度红色荧光的捕获微球，在FCM FL3检测,不同的目标蛋白,PE 标记的检测抗体，在FCM FL2检测。 荧光强度即为靶蛋白量,4,5,6,CBA检测原理,Cytometric Bead Array (CBA),+,Bead Intensit
13、y FL3 (670LP),Detector Ab Intensity FL2 (585/42BP),CBA与ELISA比较,分析可溶性蛋白 定量分析结果 高灵敏度,ELISA 抗原检测的经典方法 单项检测 每项实验样本用量50-200L 酶-底物背景干扰 CV 10-20%,BD CBA 流式细胞仪自动检测 多参数同时检测 样本用量少50L 操作方便，节省时间 标准曲线自动测定，专用软件自动计算 无酶-底物背景干扰 提高检测效率 CV 5-12%,相似点,区别,CBA应用领域,血清、血浆或培养液上清等各种液相中细胞因子的浓度检测 信号传导研究，磷酸化蛋白定量分析 免疫细胞功能性研究 免疫疾病的监控 疫苗研发，药效评价，总体免疫功能分析 传染性疾病 肿瘤研究,卵巢癌化疗前后Thl和Th2类细胞因子的表达,Thl和Th2失衡，向Th1偏移,FCM的相关科研应用,淋巴细胞及其亚群 细胞周期和倍体分析 凋亡检测 肿瘤相关基因表达的研究 肿瘤的信号转导通路的研究 耐药机制的研究 增值标志物分析 效靶杀伤的研究 肿瘤干细胞研究,谢谢！,
