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1、遵义医学院 硕士学位论文 封闭人群高龋儿童唾液微生物的构成分析 姓名：罗爱华 申请学位级别：硕士 专业：口腔临床医学 指导教师：杨德琴 20100501 遵义医学院硕：L 学位论文封闭人群高龋无龋儿童唾液微生物的构成分析 封闭人群高龋无龋儿童唾液 7 微生物的构成分析 硕士研究生： 导W - 罗爱华 杨德琴教授 中文摘要 龋病是人类最常见的牙齿疾病，引起牙体硬组织的进行性破坏。龋病的发生、发 展与口腔生态系中的微生物等密切相关。唾液作为口腔微生物的储存库和转运媒介， 像一把“双刃剑与龋病的发生有着密切的联系，作为牙齿的外环境，一方面唾液在 增强牙齿的抗龋能力方面起到重要的作用，另一方面唾液为细
2、菌在口腔中的定植提供 良好的生态环境和营养从而对龋病的发生有一定的促进作用。口腔中不同的微环境 ( 牙齿、唾液、唇、舌、颊粘膜、腭粘膜等) 具有不同的微生态特点，国内外已开始 对菌斑生物膜及粘膜软组织的微生物构成进行分析，尚缺乏对唾液微生物分布的整体 认识，而唾液微生物构成在龋病病因研究和防治中的重要意义是不容忽视的。封闭人 群因其居住环境、生活方式、饮食结构、遗传背景相对固定一致，微生物在感染性疾 病病因中占有更主导的位置、可比性更强，目前以封闭人群为对象进行口腔微生物整 体构成和疾病发生的研究未有报道。 目的：本研究使用人类口腔微生物D N A 微阵列( T h eH u m a nO r
3、 a lM i c r o b eI d e n t i f i c a t i o n M i c r o a r r a y ，H O M I M ) 对封闭人群牙菌斑来源的同批少数民族儿童唾液样本进行检 测，通过唾液中微生物分布的高通量检测，与牙菌斑微生物组成进行比较和综合分析， 以全面整体地认识口腔中不同部位微生物多样性、口腔微生态整体环境( 牙菌斑和唾 液) 和龋病发生的相关性；同时通过实时荧光定量P C R 对相同唾液样本中变异链球 菌、远缘链球菌、口腔链球菌、乳酸杆菌、内氏放线菌等公认致龋菌进行检测，旨在 对实时荧光定量P C R 定量方法反映微生态环境中不同微生物构成作出客观的
4、初步评 价。 遵义医学院硕士学位论文封闭人群高龋无龋儿童唾液微生物的构成分析 方法：样本分别取自3 0 个高龋儿童和2 0 个无龋儿童的唾液，提取唾液总D N A ，行1 6 S r R N A 特异性序列片段P C R 扩增，产物经荧光素C y 3 - d C T P 标记后与基于1 6 S r R N A 寡核 苷酸探针所制备的H O M I M 杂交，专用软件处理数据：应用S Y B RG r e e nI 模式的荧光 定量P C R 检测唾液中变异链球菌，口腔链球菌，远缘链球菌，乳酸杆菌，内氏放线菌 使用聚类分析、秩和检验及卡方检验等结果进行统计学分析。 结果：D N A 微阵列分析发
5、现( 1 ) 高龋组和无龋组共5 0 名受试者唾液样本中共检测到 9 4 个荧光带分别归属于6 个门类，3 0 个属。高龋组个体唾液微生物种型或类群数量 ( 中位数3 3 ) 高于无龋组( 中位数2 5 ) ，差异有统计学意义( P ，8 ) 。受试者 均无涎腺疾病，无其他口腔疾病，无家族遗传疾病，无全身系统性疾病，无长期服药 史。 贵州省铜仁地区松桃苗族自治县牛郎镇是典型的农业乡镇，该地区的人群平时主 要以食玉米、大豆、薯类、蔬菜等为主，饮食结构单一。由于受历史及地域原因，极 少与外族通婚，人口流动性小，且当地经济水平很低极少受医疗因素影响，人们的口 腔卫生保健等意识极差。 图1 贵州省铜仁
6、地区松桃苗族自治县牛郎镇 F i 9 1 N i u l a n gt o w no fS o n g t a oM i a om i n o r i t ya u t o n o m o u sc o u n t y ，T o n g r e n ，G u i z h o u 遵义医学院硕士学位论文 封闭人群高龋无龋儿童唾液微生物的构成分析 图2 义诊及儿童思龋情况调查 F i 9 2 P r 0 、，i d i n gf r e ec l i n i ca n di n v e s t i g a t i o no fc a r i e sf o rc h i l d r e n 3 2
7、唾液样本采集 在唾液采集前，均向学校及家长讲明实验目的及过程，并获得同意( 见图3 ) 。 采集唾液前禁食1h 并用蒸馏水漱口；采集时患者轻轻向4 无菌收集管内吐 出唾液，持续5m i n ，冰浴下转- 2 0 。冰箱，干冰下运回实验室以备提取唾液混合D N A 。 图3 样本采集及口腔卫生宣教 F i 9 3 S a m p l ec o l l e c t i o na n do r a lh e a l t he d u c a t i o n 遵义医学院硕士学位论文封闭人群高龋无龋儿童唾液微生物的构成分析 3 3 唾液混合D M 提取 ( 1 ) 从8 0 。冰箱中取出样本，完全融化后
8、，1 3 0 0 0 r p m5 m i n ，弃上清，沉淀用T E 缓冲液反复洗涤至少五次后，依次加入4 0 山D B 液，1 6 0 9 l 溶菌酶和8 9 lR N a s e A 彻底 悬浮，一3 7 “ C1 2 0 m i n ，期间来回轻柔颠倒E P 管数次； ( 2 ) 加入2 0 0 9 lD L T 液和2 5 1 BP r o t e i n a s eK ，迅速温和地来回颠倒E P 管侧地混匀， 置于6 5 。温浴9 0 m i n ，期间来回颠倒E P 管数次，以1 3 0 0 0 r p m 离心5 m i n 后，将上清 全部转入一个干净的离心管中； ( 3 )
9、 加入2 0 0 9 l 无水乙醇，混匀后全部转入吸附柱中，1 2 0 0 0 r p m 离心2 m i n ，倒 掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中； ( 4 ) 加入5 0 0 9 lW G P 液，静置2 m i n 后，1 2 0 0 0 r p m 离心9 0 s ，倒掉收集管内液体， 将吸附柱放回收集管中； ( 5 ) 加入5 0 0 9 lW G P 液，1 2 0 0 0 r p m 离心9 0 s ，倒掉收集管内液体，将吸附柱放 回收集管中，离心3m i n ； ( 6 ) 将吸附柱移入一个干净的1 5 m l 的E P 管中，在吸附柱中央加入9 0 mT l 液， 6
10、5 。静置5 m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 m i r a ( 7 ) 核酸质量检测： D U 8 0 0 紫外分光光度计测定D N A 在波长2 6 0 n m 和2 8 0 n m 处的吸光度值( O D 值) ； l 琼脂糖凝胶电泳9 0 V 、10 0 r a i n ： ( 8 ) 8 0 过夜后于旋转真空泵5 小时冻干D N A 样本，4 冰箱保存。 3 4 美国哈佛大学福赛牙科中心样本检测 H O M I M 微阵列检测，将样本中经标记的不同细菌特异性的1 6 Sr R N A 基因序列 扩增产物与包括数百种根据不同菌种1 6 Sr R N A 序列而设计
11、合成的寡核苷酸探针微阵 列芯片杂交，不同探针的一个杂交信号，代表样本中一个相应的1 6 Sr R N A 基因，从 而可检测出相应的细菌( 图4 ) 。 遵义医学院硕士学位论文 封闭人群高龋无龋儿童唾液微生物的构成分析 图4 人类口腔微生物芯片检测 F i g 4t h ep r o g r e s so f H O M I M 3 4 1 微阵列的设计与排布 芯片可固定4 6 0 个寡核苷酸探针，可检测3 0 0 多种不同的细菌。其设计与排布如 下： ( 1 ) 总共8 个矩阵 ( 2 ) 每一个矩阵大小为：1 5c o l u m n sX8r O W S ( 3 ) 探针的总数为：1 5
12、c o l u m n sX8r o w sX8b l o c k s = 9 6 0 s p o t s ( 4 ) 将寡核苷酸探针固定在芯片上，一式两份，一份排布于1 - 4 微阵列矩阵，另一份 排布于5 8 微阵列方格矩阵； ( 5 ) 每一个微阵列矩阵探针的总数为：1 5X8X4 = 4 8 0s p o t s 在这4 8 0 个探针位点中，包括阳性对照探针位点和阴性对照探针 b l a n k ：2空白对照2 个 B u f f e r ：8 缓冲组8 个 N e g a t i v eC o n t r o lI A C 3 2 ：4 阴性对照I A C 3 24 个 o l i
13、 g op o o l _ 1 ：1 寡核苷酸探针群一1 3 个 o l i g op o o l _ 10 ：1 o l i g op o o l _ 10 0 ：1 1 6 SU n i v e r s a lI E 2 9 ：1 1 6 S 通用探针I - E 2 93 个 1 6 SU n i v e r s a l1 0IE 2 9 ：1 1 6 SU n i v e r s a l1 0 0IE 2 9 ：l 因此，可利用的寡核苷酸探针 图5 方法1 6 Sr R N A 寡核苷酸基因 芯片点样矩阵示意图 F i g 5 S c h e m a t i c d i a g r a
14、m o f H O M I M 遵义医学院硕士学位论文封闭人群高龋无龋儿童唾液微生物的构成分析 总共有：4 8 0 2 8 4 3 3 = 4 6 0 ( 图5 ) 3 4 216 Sr R N A 基因的扩增 ( 1 ) 样本稀释：将真空干燥后的固体细菌基因组D N A 以适量r E 缓冲溶液稀释至 2 0 0 n g m l ，- 2 0 “ C 保存备用； ( 2 ) 确定引物 参照B r a c eP a s t e r I S l 等先前研究建立的两对1 6 S r R N A 基因通用引物P C R 引物分别为： 上游引物5 - C C AG A G ”盯G A TY M TG G
15、 C 3 、 下游引物5 - G A AG G AG G TG W TC C AR C CG C A 3 ，； 上游引物5 - G A CT A GA G TT T G A T YM T G G C 一3 、 下游引物5 - G Y T A C CT T GT T AC G AC T T - 3 ，。 ( 3 ) P C R 反应体系： 上下引物： 2 0 p m o l 脱氧三磷酸盐：4 0 n m o l M 9 2 + ： 1 5 m M P l a t i n u mH i g hF i d e l i t y7 k qp o l y m e r a s e ： I U 菌斑总D N
16、A 样本( 模板) ：2 m 终体系： 2 5 p l d d H 2 0 补充至终体系 ( 4 ) P C R 扩增： 预变性：9 4 预变性2 r n i n 循环扩增：变性：9 4 “ C ，3 0 s 退火：5 5 ，3 0 s 延伸：6 8 ，1 5 m i n 共3 2 个循环， 最后7 8 。C 延伸1 0 m i n ， ( 5 ) 电泳：1 5 琼脂糖凝胶电泳检测P C R 产物。 2 2 遵义医学院硕： ：学位论文封闭人群高龋无龋儿童唾液微生物的构成分析 3 4 3 标记P e R 产物 ( 1 ) P C R 扩增：按照“巢式“ 扩增法获得C y 3 - d C T P 荧光标记的P C R 产物。 引物序列：上游引物5 - G A G1 陌G A T Y M TG G CT C A G 一3 、 下游引物5 - G Y T A C C 订GT T AC G AC T T - 3 。 ( 2 ) P C R 反应体系： 上下引物：
