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1、 Western Blot 步骤步骤 北京协和医学院 阜外心血管病医院 心外科 心血管病国家重点实验室 北京协和医学院 阜外心血管病医院 心外科 心血管病国家重点实验室 吴益和吴益和 一心肌总蛋白提取（一）一心肌总蛋白提取（一） TRIzol Reagent 蛋白质的提取蛋白质的提取 1. 准备试剂：1. 准备试剂：异丙醇；含0.3M 盐酸胍的95%乙醇； 无水乙醇； 1%SDS。 1. 含0.3M 盐酸胍的95%乙醇： 盐酸胍（分子量95.53） ：95%乙醇=14.3295g：500ml 21%SDS： SDS：H2O=0.5g：50ml 2. 操作步骤： 2. 操作步骤： 1. 取沉淀
2、DNA 后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol 加 1.5ml 异丙醇，室温放置10分钟，2812000g 离心10分钟弃上清； 2. 准备0.3M 盐酸胍（guanidine hydrochloride）的95%乙醇洗涤液； 3. 用含0.3M 盐酸胍（guanidine hydrochloride）的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。 每使用1ml TRIzol 加2ml 洗涤液，室温放置20分钟（Note:（Note: .蛋白质沉淀可蛋白质沉淀可 保 存 在 含保 存 在 含 0.3M 盐 酸 胍 的盐 酸 胍 的 95%乙 醇 中乙 醇 中 2 8 一 个 月 以 上 或
3、 一 个 月 以 上 或 -20 一 年 以 一 年 以 上）上） ； 4. 287500g 离心5分钟，弃上清； 5. 重复3-4两次以上； 6. 在三次洗涤后加2ml 无水乙醇到蛋白质沉淀中，涡旋混匀15秒（Note:（Note: .蛋蛋 白质沉淀可保存在无水乙醇中白质沉淀可保存在无水乙醇中28一个月以上或一个月以上或-20一年以上）一年以上） ； ； 7. 室温下孵化20分钟； 8. 287500g 离心5分钟，弃上清； 9. 风干蛋白质沉淀5-10分钟(可以延长时间直到满意为止)，不要干燥过度； 10.蛋白质重悬浮： 1）用1% SDS（十二烷基硫酸钠）溶解蛋白质(200 L)，反复吸
4、打，50温浴 使其完全溶解； 2）2810000g 离心10分钟除去不溶物； 3）将包含蛋白质的上清转移到新的 EP 管中（此时分离得到的蛋白质样品可 直接用于 Western Blot（之前先测浓度）（之前先测浓度）或-20保存备用） ； 4） 因为不同溶剂中某些蛋白质的溶解性不同， SDS 溶液中蛋白质的可溶性差， 如果蛋白质沉淀在 SDS 溶液中不可溶， 那么可以选择下面的溶剂(Hummon et. al., 2007)来溶解蛋白质沉淀： 1% SDS and 62.5 mM sarkosyl（肌氨酰:裂解病毒颗粒或感染细胞的一种去污 剂） at pH 8.08.8； 9.5 M ure
5、a and 2% CHAPS, pH 9.1； 250mM glycerol（甘油）, 10mM TEA, and 4% CHAPS； 2% diethylamine（二乙胺） ； 10M Urea（尿素） 。 3. 常见问题分析： 3. 常见问题分析： 1. 得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底；B.最后得到的蛋白质沉淀未完全 溶解。 2. 蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。 3. 电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。 要不直接用裂解液或 SDS 缓冲液来代替 1% SDS 溶解蛋白质 要不直接用裂解液或 SDS 缓冲液来代替 1% SDS 溶解蛋白质 采用上述方法提取的蛋白，可以
6、用 lowry 法或 BCA 法进行蛋白定量 一一心肌总蛋白提取（二） 心肌总蛋白提取（二） 裂解液法提取总蛋白 裂解液法提取总蛋白 1材料 1材料 心肌：手术室活检标本 试剂：蛋白裂解液,碧云天，产品编号 P0013 仪器：组织匀浆机，Tekmar 2方法和过程： 2方法和过程： (1) 将心肌组织块（222mm）放入含有裂解液的 1.5ml EP 管中（裂解液含量视组织量而 定） ，用微量匀浆器进行冰上迅速低温匀浆，直到看不见颗粒为止。 （如果需要测磷酸化蛋白，则在裂解液中加入磷酸酶抑制剂（普利来公司） ，具体方法 见说明书） （如果需要测磷酸化蛋白，则在裂解液中加入磷酸酶抑制剂（普利来公
7、司） ，具体方法 见说明书） (2) 将匀浆液移至 EP 管中，冰上放置 10 分钟，14000rpm/min，4，离心 15 分钟，取上 清，-80保存备用，待测浓度。 二蛋白浓度测定 二蛋白浓度测定 1材料准备：材料准备： 试剂：碧云天 BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型） 产品编号 P0010 仪器：酶标仪（BIO-RAD 680） 2方法步骤（见试剂盒说明书） ：方法步骤（见试剂盒说明书） ： (1) 取 1.2ml 蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（30mg BSA）中，充分溶解后配制成 25mg/ml 的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可-20长期保存； (2) 稀释标准品：取适
8、量 25mg/ml 蛋白标准，稀释至 0.5mg/ml(蛋白样品在什么溶液中，标 准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用 0.9%NaCl 或 PBS 稀释标准品)。 (蛋白样品在什么溶液中，标 准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用 0.9%NaCl 或 PBS 稀释标准品)。 稀释后的 0.5mg/ml 蛋白标准也可-20长期保存； (3) 配制 BCA 工作液：按 50 体积试剂 A 加 1 体积试剂 B 配制适量工作液，充分混匀（配 制的量视样本量而定，200l/孔） 。工作液室温 24 小时内稳定。 (4) 加标准品：将标准品按 0、1、2、4、8、12、16、2
9、0l 加入 96 孔板的标准品孔中（做 副孔） ，加标准品稀释液补足到 20l。 (5) 加样品：加 2l 样品到 96 孔板的样品孔中，加 18l PBS(最好用 1%SDS 或裂解液，保 持与原样本中的一致) (最好用 1%SDS 或裂解液，保 持与原样本中的一致)，使总体积达到 20l。 (6) 加工作液：每孔加入 200l 步骤 2 所配制工作液。 (7) 37静置 20-30 分钟。可室温放置 2 小时。 (8) 酶标仪测定 A562，540-595nm 之间的波长也可接受。 (9) EXCEL 绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。 附：倍比稀释方法 附：倍比稀释方法 1.
10、 取 8 个 EP tubes； 2. 第 1 管加入 25l 0.5mg/ml蛋白标准品， 其余各管加入 25l ddH2O(最好用最好用 1%SDS或裂解 液，保持与样本中的一致 或裂解 液，保持与样本中的一致)； 3. 向第 2 个 tube 中加 25l BSA 蛋白标准品， 混合均匀后从第 2 个 tube 中取 25l 稀释后的 BSA 到第 3 个有 25l ddH2O 的 tube 中，混合均匀；再从第 3 个 tube 中取 25l 第二次 稀释后的 BSA 到第 4 个有 25l ddH2O 的 tube 中；直到第 7 个 tube； 4. 第 8 个管为空白孔，单加dd
11、H2O(最好用最好用 1%SDS或裂解液，保持与样本中的一致或裂解液，保持与样本中的一致)； 5. 如此配制出稀释了 1 倍，2 倍，4 倍，8 倍，16 倍，32 倍,64 倍，空白的蛋白标准品 溶液。 三三Western Blot 用蛋白样品制备用蛋白样品制备 1材料：材料： 5loading buffer（普利莱公司） 或 4loading buffer（Takara 公司）公司） 2方法：方法： 样品 40g 蛋白量 10-40g, 我的 20g 足已 4l（20l 体系）/6l（30l 体系）5SDS loading buffer 或 4loading buffer 5l（20l 体
12、系）/7.5l（30l 体系） 上样缓冲液中含有 DTT，不 需要再加 DTT 加 ddH2O 至总体积 20l（30l） 100，加热 5min 使蛋白变性，立即放冰中速冷，-20放置备用。 （上样总体积一般不超过 20l，加样孔的最大限度可加 30l 样品。 ） 四聚丙稀酰胺凝胶电泳四聚丙稀酰胺凝胶电泳 1. SDS 聚丙稀酰胺凝胶的配制（自制胶） 1. SDS 聚丙稀酰胺凝胶的配制（自制胶） 准备：准备：玻璃板用水冲干净，直立晾干，餐巾纸擦干净。 装上玻璃板，前后推动，最后往前拉些距离，扣上开关。 槽下面的海绵条带些水，可以部分抵抗漏水。 放装有玻璃板的架子于槽上，先放下部，再靠上部，加
13、紧。 加入水，液面稍高些，等 15 分钟，看是否漏水。然后拿整个槽将水倒掉，再用吸水 纸吸干玻璃板内的残余水份。 1）安装玻璃板 ? 玻璃板洗干净即可 ? 小玻璃板向前， 两玻璃板间夹上 spacer， 拧紧螺栓固定 （安装一定要平， 防漏水） ? 加满蒸馏水，看是否漏水，静置 15min（记录漏液体积，以胶补充） ? 用窄滤纸条吸干两玻璃板间的水滴 2）按分子量配制一定浓度的分离胶（12%，体积 10ml） ddH2O 3.3ml 30%丙烯酰胺溶液 4.0ml 1.5 mol/L Tris（PH8.8） 2.5ml 10%SDS 溶液 100l 10%过硫酸铵（AP） 100l TEMED
14、 4l ? 加 TEMED 之前，充分混匀内容物，一旦加入 TEMED，快速旋动混合物。 ? 在两玻璃板的间隙中灌胶，每板约 3.5ml，加至旁边绿色柱子的上缘（如开始有漏液 现象，则要补上漏的那部分体积） ? 在胶溶液上加满ddH2O（或加无水乙醇可以消泡）（或加无水乙醇可以消泡） ，室温 30min（可防止氧气扩散进入 凝胶而抑制聚合反应） 附：附： 标准的：SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 标准的：SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（kDa） 15 10-43 12 12-60 10 20-80 7.5 36-94 5.0 57-212 网上的：分
15、子量范围与凝胶浓度的关系网上的：分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 5105 2-5 核酸(RNA) 150 kDa migrate more slowly, and require more time to transfer. If your protein of interest is in this size range, it may be necessary to use a Run Time of 810 minutes for your transfer. 3）Small proteins 80 的，建议 18V，16 分钟） （他们的：2
16、5V，30 分钟，具体需根据预实验调 整） 5. 电转 15min 后关闭装置； ? 取下硝酸纤维素膜，去离子水漂洗膜； ? 丽春红染色 510min，轻摇。 ? 蛋白带出现后，TBST 洗膜，圆珠笔标出 marker 位置。若不继续做，则冰箱保存。 六Western blotting 六Western blotting 试剂准备： 1. 10TBS 缓冲液缓冲液 1L Tris 碱 24.2g NaCl 80g 定容 1L 浓 HCl 调节 PH 到 7.6 2. 1TBST 缓冲液缓冲液 1TBS (pH 7.6) 1L Tween20 1000l 快速搅拌 34h。 3. 封闭液封闭液 脱脂奶粉
