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1、技术与方法 生物技术通报 BloTECHNoLoGY BULLETIN 201 1年第9期 表观遗传学研究方法进展 郑小国 陈亮 楼巧君 罗利军 ( 上海市农业生物基因中心，上海201106； 华中农业大学，武汉430070) 摘 要： 表观遗传调控是基因表达调控的重要组成部分，已成为当前研究的热点。目前其研究主要集中在DNA甲基化 和组蛋白修饰。针对这两种表观修饰，其研究方法也取得了较大进展，一方面方法的灵敏度和特异性都在不断提高；另一方 面表观修饰的检测正在逐步从定性检测向定量分析方向发展，从个别位点向高通量检测发展。此外，新一代测序技术的应用 将大大推动表观遗传研究的发展，包括单分子实时
2、测序法、单分子纳米孔测序法等。综述目前常用的DNA甲基化、组蛋白修 饰研究方法以及最新的单分子测序技术，并对它们在表观遗传修饰检测中的应用作了简要对比分析。 关键词：表观遗传学DNA甲基化组蛋白修饰 限制性内切酶酶切法 重亚硫酸盐法 染色质免疫共沉淀 单分 子实时测序 单分子纳米孔测序 Research Method Progress of Epigenetics Zheng Xiaoguo Chen Liang Lou Qiaojun Luo Lijun ( Shanghai Agrobiological Gene Center，Shanghai 201106；2Huazhong Agric
3、ultural University，Wahan 430070) Abstract： Epigenetic regulation has become a hotspot in the study on gene expression regulationEpigenetic regulation mainly fo cuses on DNA methylation and histone modificationA great deal of techniques has been developed to detect these epigenetie modifica- tions an
4、d great progresses have also been achieved in terms of detection sensitivity and specificity，qualitative and quantitative assay The nextgeneration sequencing technologies will greatly promote the development of epigenetic research providing a chance for rapid and high throughput epigenetic detection
5、，which include the singlemolecular，realtime sequencing，single-molecule nanopore DNA se- quencingThis review introduced the most commonly used and newly developed techniques，and made a brief comment about their ap plications in the detection of DNA methylation and histone modification Key words： Epig
6、enetic DNA methylation Histone modification Restriction endonuclease enzyme digestion Bisulfate Chromatin immunopreeipitation(ChIP) Singlemolecular realtime sequencing Singlemolecule nanopore DNA sequencing 表观遗传(epigenetic)是指DNA序列不发生变 化，但基因表达却发生了可遗传的改变。这种改变 是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生 的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程
7、中能稳 定遗传 。 表观遗传学的现象很多，DNA甲基化(DNA methylation)、组蛋白修饰(histone modification)、基 因组印记(genomic imprinting)、RNA编辑(RNA edi- ring)、基因沉默、核仁显性、休眠转座子激活和性别 相关性基因剂量补偿效应等都是典型的表观遗传现 象 。表观遗传研究目前主要集中在DNA甲基 化和组蛋白共价修饰两方面。 DNA甲基化(DNA methylation)是常见的表观 遗传现象，它是指在DNA甲基转移酶(DNA methyl transferases，DNMTs)的作用下将甲基添加在DNA 分子中的碱基上
8、。常见的DNA甲基化发生在DNA 链上的胞嘧啶(C)第5位碳原子和甲基间的共价结 合形成5甲基胞嘧啶(5mC) 。除此以外，在腺 嘌呤(A)N6位置可以引入一个甲基形成N6甲基腺 嘌呤(N6mA)。在真核生物中，DNA甲基化主要发 生在CpG二联核苷酸上，也常在植物基因组CNG 和CNN序列上发现 。在某些区域，CpG序列密 收稿日期：2011 0407 作者简介：郑小国，男，博士研究生，研究方向：表观遗传学；Email：ZXgO8sageorg 通讯作者：罗利军，男，研究员，博士，研究方向：水稻节水抗旱；E-mail：lijunsageorgcn 生物技术通报Biotechnology Bu
9、lletin 201 1年第9期 度很高，可达均值的5倍以上，成为c和G的富集 区，就像在DNA序列汪洋大海中浮现的一座座孤 岛，称为CpG岛(CpG islands) 。作为表观遗传学 最重要的现象之一，DNA甲基化对基因的表达发挥 着重要的调控功能，涉及异染色质形成、转座子扩散 防御、基因印迹、源基因表达调控、转基因沉默和细 胞分化等，在生命活动中起着重要的作用 川。 组蛋白共价修饰(histone modification)包括 ： 乙酰化(acetylation)、甲基化(methylation)、磷酸化 (phosphorylation)、核糖化(ribosylation)、泛素化
10、(ubiquitylation)和类泛素化(sumoylation)。这些修 饰共同构成了可以通过特殊解码蛋白解读的组蛋白 密码，在解码过程中影响基因表达 ” 。其中乙酰 化和甲基化主要发生在组蛋白lys残基上，乙酰化 与转录激活相关；甲基化既可能与转录激活相关，也 可能与转录抑制相关，激活或抑制取决于甲基化1ys 位点以及添加的甲基基团数目 ” ，每个lys残基 可以加上13个甲基基团，形成单甲基化、二甲基 化、三甲基化3种形式，每种形式有其独特的功 能 。磷酸化是另外一种重要的调控方式 ，在 基因转录、DNA修复、细胞凋亡以及染色质凝聚等 过程中起重要作用。核糖化 是指组蛋白H1、 H2A
11、、H2B及H3和多聚ADP核糖的共价结合， ADP一核糖基化被认为是在真核细胞内启动复制过 程的扳机；泛素化 是指将被降解的蛋白质连接上 泛素标记，一些可以诱导基因启动子区域的H2B组 蛋白会被修饰以启动基因表达；类泛素蛋白E2O (small ubiquitinlike modifiers，SUMO)对蛋白质的翻 译后修饰被认为与蛋白质的细胞内定位、稳定性和 转录活性有关，也可能参与异染色质结构的调节。 近年来，人们越来越认识到表观遗传在基因表 达调控方面的重要性，并开发出一系列检测表观遗 传修饰的方法，尤其是DNA甲基化和组蛋白修饰检 测方法取得了较大进展，一方面方法的灵敏度和特 异性都在
12、不断提高；另一方面表观修饰的检测正在 逐步从定性检测向定量分析方向发展，从个别位点 向高通量检测发展。 1 DNA甲基化研究技术 目前全基因组或接近全基因组甲基化检测技术 较多，主要分为3类：第1类技术以限制性内切酶酶 切为基础，用一个或多个酶限制性切割未甲基化 DNA(如Hpa II和Not I)或甲基化DNA(如 McrBC)。这些方法结合芯片、毛细管测序 等技 术已经检测了多种生物的全基因组甲基化，但仅限 于内切酶能够识别的CpG位点。第2类技术依赖 于全基因组DNA重亚硫酸盐转换，经重亚硫酸盐处 理后基因组DNA未甲基化胞嘧啶(C)转换为尿嘧 啶(U)(经扩增后最终为T)，甲基化c保持
13、不 变 。此方法可以进行单CpG位点解析并且可以 结合芯片或高通量测序。但此方法的局限性在于经 过重亚硫酸盐转换后，序列特异性降低，在芯片上难 以设计足够的特异性探针进行全基因组分析。此 外，如果用于较大基因组13常分析，此方法十分昂 贵。第3类技术以免疫学为基础，用5一甲基胞嘧啶 特异性抗体或者用含有甲基结合结构域的蛋白通过 免疫沉淀富集基因组甲基化或未甲基化片段 ，称 为甲基化DNA免疫共沉淀(methylated DNA immu noprecipitation。MeDIP or mOIP) ，MeDIP结 合芯片(MeDIPchip)技术可以对任何物种进行高通 量全基因组DNA甲基化作
14、图 。 以上3类技术可以与测序或芯片技术组合形成 多种方法：如酶切结合测序、酶切结合芯片技术、亚 硫酸氢钠结合测序、亚硫酸氢钠结合芯片技术、免疫 沉淀结合测序和免疫沉淀结合芯片技术等。 11 以限制性内切酶为基础的DNA甲基化检测 技术 111 甲基化敏感扩增多态性(methylation sensi tive amplification polymorphism，MSAP) 本方法是 在扩增片段长度多态性(amplified fragment length pol ymorphism，AFLP)技术的基础上建立起来的 ” 。 其基本程序是：提取基因组DNA，根据Hpa II、Msp I 两种
15、酶对甲基化敏感程度不同，分别用EcoR IHpa II、EcoR IMsp I两组酶组合对基因组DNA进行双酶 切，连上接头后，用按照接头序列设计的引物加上一 个选择性碱基进行PCR扩增，称为预扩增。预扩增 产物稀释后，再加入另外两个选择性碱基引物进行第 二次PCR扩增，称为选择性扩增。扩增产物变性后 在6的PAGE胶上电泳，最后采用银染或同位素放 射自显影方法处理PAGE胶，统计和分析DNA条带 即可得出基因组CpG位点甲基化状态。还可以对差 201 1年第9期 郑小国等：表观遗传学研究方法进展 65 异扩增片段回收克隆测序，通过比对可鉴定甲基化差 异位点。MSAP技术相对其他DNA甲基化测
16、定技术 有如下优点：不需知道被测DNA的序列信息；操作相 对简便，在AFLP基础上可直接操作；可在全基因组 范围检测CCGG位点的胞嘧啶甲基化变化。MSAP 技术的局限性在于只能检测CCGG位点的胞嘧啶甲 基化。此方法常用于研究动植物全基因组甲基化 状态。 112 McrBC酶切法McrBC是一个DNA甲基化 特异性限制性内切酶，识别(AG)C基序中甲基化 的C，切割一条或两条链上含有甲基化胞嘧啶的 DNA。McrBC不作用于非甲基化的DNA。McrBC 的DNA识别位点包含两个(GA)mC形式的半位 点。半位点的间距最长可达3 kb，但最适宜切割的 间距是55103 bp。McrBC切割时需要GTP存在， 当存在GTP的非水解类似物时，该酶可以特异性地 结合到甲基化的DNA上，而不产生切割反应。 McrBC在一对PumCG序列元件上进行切割，因此可 以检测相当大一部分的甲基化CpGs。 通常该方法结合芯片技术检测甲基化DNA，其 基本程序是：首先用McrBC酶
