微生物发酵产酶.ppt

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1、第三章 微生物发酵产酶,第一节 产酶微生物的发现及筛选,3.1 酶的来源与多样性：,80%以上的新酶来源于微生物，动物与植物来源的只占8%和4%。 微生物的多样性与丰富的资源促成了酶的多样性。 筛选微生物及其酶仍是目前发现新酶的有效和主导的方法，特别是新酶发现的初期。,获取酶源的方式：,（1）生产菌可从菌种保藏机构和有关研究部门获得 菌种保藏机构 网址 美国模式培养物保藏所（ATCC） www.atcc.org 德国微生物和细胞生产收藏中心（DSMZ）www.gbt.cle/DSMZ 中国微生物信息网 微生物菌种数据网(MSDN) www.bdt.org.br/bdt/msdn 世界微生物数据

2、中心(日本) wdcm.nig.ac.jp 大肠杆菌遗传收藏中心(CGSC) cgsc.biology.yale.edn/top.html （2）自然界是产酶菌种的主要来源 要获得生产某种酶的菌种可从富含该酶作用底物的场所去采集菌种样品。,3.2 微生物产酶的优点：,种类多、酶种丰富，而且菌株容易诱变，菌种多样； 生长繁殖快，容易提取酶，特别是胞外酶； 培养基来源广泛、价格便宜； 可以在线监控酶发酵生产过程，实现连续化、自动化，经济效益高； 可利用基因工程手段，选育菌种、增加酶产量和开发新菌种。,寻找酶要依据微生物的生境 不同环境中的微生物具有与各自生理特征和代谢类型相对应的独特的酶； 产酶微

3、生物的发现通常包括分离和筛选两个环节。 分离是通过分离技术将目标微生物从其生存的各种环境中分离出来； 筛选是以性能为目标确定合适的菌株。,3.3 微生物酶的筛选策略,3.3.1 常规酶筛选的一般策略,依据酶促反应过程和目标产物确定所需要的酶； 寻找具有这种催化活性的酶或微生物； 1）从商品酶库中筛选，如Sigma、Novo Nordisk等，最快、最简单，但品种有限； 2）从保藏微生物菌株中筛选，如CGMCC、ATCC、UKNCC等，此外，可从一些公开的微生物数据库查阅有关酶源信息，如MINE、MSDN、世界微生物数据中心等； 3）自然界发现和筛选产酶微生物，注意采样环境； 4）从基因克隆库中

4、筛选。,发酵周期短,产酶量高； 微生物尽可能地利用便宜和方便的原料生产酶； 所产酶最好具有比较高的专一性，没有或很少有生产副产物的杂酶； 所用微生物是不产生有害物质的非致病性的安全微生物； 微生物的遗传稳定性高。 由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。 非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。,一般产酶微生物的筛选原则：,建立有效和方便的筛选分析方法； 1）基于酶的特殊活性，如嗜热； 2）基于底物； 3）借助液相色谱仪或气相色谱分析； 一般采用分级筛选。,3.3.2 从极端微生物中筛选酶的策略,极端微生物是开拓商业化新酶的有效资源； 培养极端微生物生产酶的时候要考虑微生

5、物的特点，如多种超高温嗜热菌在培养基中有无机硫的时候，发酵会产生大量H2S，所以不能用一般的不锈钢发酵罐； 采用中间微生物宿主表达生产极端酶的时候，需要在类似极端微生物生长的生境下才可以得到折叠成天然构型的酶。 极端微生物产培养基成分要接近生境。,3.3.3 不可培养微生物中酶的发现策略,不可培养微生物是地球上最大的尚未开发的自然资源； 采用分子筛选，从元基因组中筛选酶基因，然后克隆，表达。,从自然界发现产酶微生物 一般按采样、富集、分离与初复筛等几个步骤； 产酶微生物及酶的高通量筛选。 单克隆菌落在平板上的固定、培养以及液体几种的自动化技术可以一周筛选1000以上各菌落。,3.4 微生物和酶

6、的一般筛选方法,自然选育 自然环境或微生物自身代谢产生的诱变物质； 诱变选育 1）营养缺陷型突变株 2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株 3）组成型突变株，解除对诱导物的依赖 4）抗性突变株，特别是抗噬菌体菌株,3.5 菌种选育,第二节 微生物酶的发酵生产,一、优良的产酶微生物具备的条件：,（1）酶的产量高； （2）产酶稳定性好； （3）容易培养和管理； （4）利于酶的分离纯化； （5）安全可靠、无毒性等。,目前主要商品酶制剂及其来源,目前主要商品酶制剂及其来源,目前工业用主要酶的生产菌来源,目前工业用主要酶的生产菌来源,美国同意使用的食品用酶及生产菌种,二、 产酶菌种的保藏 1）低温保藏 2）干

7、燥保藏 3）产酶菌种的退化与活化复壮,四、菌种的培养,固体培养法：以麸皮、稻草、米糠等农副产品作为营养源，加少量水，使之呈固体形式的培养基，接种，并在合适的温度下培养，使其生产并形成酶。 液体培养法：用三角瓶装适当的液体培养基，在摇床振荡一定时间。,四、酶的发酵工艺条件与控制,1、培养基,各种生物对营养的需求,1、选择适宜的营养物质 2、营养物的浓度及配比合适 3、物理、化学条件适宜 4、经济节约 5、精心设计、试验比较,培养不同的微生物必须采用不同的培养条件； 培养目的不同，原料的选择和配比不同； 不同阶段，培养条件也有所差异。,培养基的设计原则,实验室的常用培养基： 细菌： 牛肉膏蛋白胨培

8、养基（或简称普通肉汤培养基）； 放线菌：高氏1号合成培养基培养； 酵母菌：麦芽汁培养基； 霉菌： 查氏合成培养基；,例如枯草芽孢杆菌： 一般培养：肉汤培养基或LB培养基； 自然转化：基础培养基； 观察芽孢：生孢子培养基； 产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；,五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水,培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础。,培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。,任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素。,构成细胞物质或代谢产物中碳架,碳源可作能源，为生命活动提供能量,常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、

9、烃类、蛋白质及其降解物,异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）,水是微生物最基本的组成分（） 水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物） 水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动 调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）,水,碳源,选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制,构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ）,氮源,有机氮源,蛋白胨、酵母膏、牛肉膏,无机氮源,铵盐、硝酸盐,参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性 维持细胞结构的稳定性 调节细胞渗透压 控制细胞的氧化还原电位 有时可作某些微生物生长的能源物质,常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等

10、元素的化合物。,氮源,无机盐,需要注意合适的碳氮比,生长因子,生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。,分类： 化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分 等四类,功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应,实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子,2、发酵条件的控制,培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。,通常培

11、养条件： 细菌与放线菌：中性或碱性范围（pH6.58.0） 酵母菌和霉菌：偏酸性(pH46) 植物细胞生长的最适pH值为56,（1）pH值的控制,pH值对产酶的影响,在发酵过程中，微生物不断进行着各种代谢反应，代谢产物能直接影响着pH值。培养基成分中C/N比高，发酵液倾向于酸性； C/N比低，发酵液倾向于碱性。 通气量的影响：通气量足，糖、脂类物质能完全氧化，最后产物为CO2和H2O；通气量不足，糖、脂类物质氧化不完全，则会生产中间产物有机酸。 盐利用的影响：强酸类盐的利用会引起pH值下降，强碱类盐的利用会引起pH值的上升。 碳源不足时，也会因利用氨基酸的碳架而引起pH值的变化。,调节pH的方

12、法：,（1）调节培养基的原始pH，保持一定的C/N比； （2）添加缓冲液，保持pH一定范围； （3）调节通风量，使氧化还原电位保持一定的值； （4）发酵液pH高用糖或淀粉调节，过低通过氮调节。,细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。,有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。例如，采用米曲霉发酵生产蛋白酶时，当培养基的pH值为碱性时，主要生产碱性蛋白酶；培养基的pH值为中性时， 主要生产中性蛋白酶；而在酸性的条件下，则以生产酸性蛋白酶为主。,通常在生物学范围

13、内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。,（2）温度的控制,枯草杆菌的最适生长温度为3437,黑曲霉的最适生长温度为2832 ,通风及搅拌速度对发酵温度均有影响。,代谢反应对温度的影响： 发酵过程中，微生物在发育过程中，不断进行合成代谢与分解代谢反应。在发酵初期，合成反应占优势，所以发酵液需要升温。当菌体繁殖旺盛时，分解代谢旺盛会带来大量热量，故发酵液需要降温。,细胞必须获得充足的氧气，使从培养基中获得的能源物质（一般是指各种碳源）经过有氧降解而生成大量的细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量ATP。 在培养基中培养的细胞一

14、般只能吸收和利用溶解氧。在发酵过程中必须不断供给氧（一般通过供给无菌空气来实现），使培养基中的溶解氧保持在一定的水平。 溶解氧的调节控制，就是要根据细胞对溶解氧的需要量，连续不断地进行补充，使培养基中溶解氧的量保持恒定。,（3）溶解氧的控制,在酶的发酵生产过程中， 处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。,培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触

15、面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。,调节通气量 调节氧的分压 调节气液接触时间 调节气液接触面积 改变培养液的性质,控制溶解氧方法,（4）搅拌：,（1）有利于热交换，使营养物质和菌体均匀接触，降低细胞周围的代谢产物，从而有利于新陈代谢； （2）打破空气气泡，使发酵液形成湍流，增加湍流速度，从而提高溶氧量，增加空气利用。但搅拌易产生切应力，使细胞受损，同时带来一定的热量，使发酵液温度发生变化。搅拌与发酵液粘度有关。,（5）泡沫影响,泡沫的存在 （1）阻碍二氧化碳的排除； （2）影响溶氧量； （3）影响添料； （4）发酵液易溢出罐外。 消除

16、措施： （1）机械消泡； （2）消泡剂：天然的矿物油、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、硫酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷和聚硅酮。其中，以聚甲基硅氧烷最好。,4、 酶生物合成的调节,酶生物合成的诱导和阻遏 诱导作用(induction)：诱导物使酶合成增加的过程 阻遏作用(repression)：阻遏物使酶合成减少的过程,酶合成诱导的现象Jacob and Monod的工作： 已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶； -半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。 实验： 1.大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成； 2.大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本消失； 3.表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。,本世纪三十年代，H.Karstrom在对糖代谢过程中的某些酶的合成进行研究时提出：诱导酶与组成酶,适应型酶（Adaptive enzyme）或调节型酶（Regulated enzyme）：生物细胞中合成的酶的含量变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响。如大肠杆菌-半