《mtt相关技巧大汇总》由会员分享,可在线阅读,更多相关《mtt相关技巧大汇总(26页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、MTT相关技巧大汇总(一)实验前应明确的问题1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。2.药物浓度的设定。一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记!否则,可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度
2、和时间。3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值,输入excel表,最后得到不同时间点的抑制率变化情况,画出变化的曲线,曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。4.培养时间。200ul的培养液对于10的45次方的增殖期细胞来说,很难维持68h,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果,我们是在48h换液的。5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。做MTT时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。7.实验时应设
3、置调零孔,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜,不同的是对照孔加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。8.避免血清干扰。用含15胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。(二)实验步骤贴壁细胞:1.收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。2.5%CO2,37孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓
4、度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况3.5%CO2,37孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。4.每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。5.终止培养,小心吸去孔内培养液。6.每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7.同时设置调零
5、孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)悬浮细胞:1)收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1106/ml,按次序将补足的1640(无血清)培养基40ul ;加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释 l?g/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);需检测物10ul;细胞悬液50ul(即5104cell/孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100?(储存液100 1640)。2)置37,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。3)每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/m
6、l,即0.5%MTT),继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值)4)离心(1000转x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。5)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。(三)MTT的配制MTT一般最好现用现配,过滤后4oC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-2
7、0度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配,60水浴助溶。PBS配方:Nacl 8g,Kcl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g,调ph 7.4,定容1L。(
8、四)关于细胞的接种(铺板)细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的(最好进口板),不好的板或重复利用的板只可做预实验。接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10000/ml左右时,所测得的OD值的区间即细胞抑制率(或者增值率)的所呈现的线性关系最好,结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显,太密细胞可能都会凋亡,因为细胞长的太快营养会不够,最后导致死亡。且而细胞过密或者过少,增殖都会过快或者过慢,其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml,100ul/孔。细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细
9、胞浓度,如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度,这样与对照的区别更明显,数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104. 其它的声音:1.首先细胞的接种密度一定不能过大,一般每孔1000个左右就够了,我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了,这样即使药物有作用,MTT方法也是表现不出的,最佳点板浓度在4000-5000/孔,太少的话SD值会很大。2.MTT本身就是比较粗的实验,增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手,20的波动也是常见的,所以很可能是技术原因引起的,特别是种板技术一定要过关。3.我做的是肿瘤细胞的MTT实验,这种细胞
10、长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过4000080000/ML的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是6000070000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时. 注意细胞悬液一定要混匀,已避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不等,可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练,尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多,但是如果操
11、作不熟,CV会在8%左右。另外,吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。首先说说我的一点经验:1.吹打时悬液总量不能太多,达到吸管吸液量的3到4倍,可能比较容易混匀。10ml的离心管里面最好装34ml的悬液:悬液太少容易吹起很多气泡,悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。2.吸管的吸液量最好在1ml左右:吸液量过多的话,一下吸起很多液体,管中所剩就很少,这样吹打容易起泡,吸液量过少,吹打的力度就不够,吹打就会不均匀。如果是吸液量1ml多的吸管,总液量在5ml左右为益3.吸的时候要在悬液底部,然后提起来一点,但是吹下去的时候不要离开液面,否则容易吹打出气泡。4.吹打次数100左右,就可以
12、吹打均匀了(有人认为加细胞前吹打3050次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次,每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟,然后再以一定的速度吸取悬液。)5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快,否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆,一般都在孔的底部中央,而周边很少,这种不均匀的分散会产生接触抑制,影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中,向左3下,向右3下,在往返回复3下移动,目的是使得细胞能分散的均匀些。(铺板技术是MTT实验的关键,也是基础,一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞,最后细胞全死了,建议不要采用这种方法混匀细
13、胞。(五)加入MTT个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例,具体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定,我认为MTT多加一些比少加好一些MTT的量各家报道不同,一般是过量的,所以10ul即够了。如果不使用96孔板,培养基超过100ul,MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混匀,不过这个应该关系不大。如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色,则污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在镜下观察,看看是否有孔染菌,染菌的孔常常是临近的因为血清中白蛋白对大部分的药物都有
14、结合效应,所以可以单独将药物和MTT加在一起,看会不会起反应。如果不起反应,就不用去除含药物的培液,直接加MTT即可。(六)如何清除上清(百家争鸣)1.加DMSO前要把液体吸掉,但培养液里的紫色结晶可能会吸去,可在这之前先用平板离心机离心96孔板,2000r,5分钟,然后吸掉上清(如果是悬浮细胞,则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉,建议各孔吸弃150-160ul即可)。2.我每次将MTT加入后,再孵育四个小时,然后用离心机离心1000G,5min。但是用枪小心地吸上清,还是会将一小部分蓝色结晶吸出。所以还
15、是建议翻转倒扣的方法吧!3.另外,可以直接将板翻转倒扣(垫几层滤纸)23次,比用“吸”的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍,或者倾斜一点帮助吸液,发现紫色结晶几乎没有肉眼可见的掉脱,但前提是你本身细胞贴壁要比较牢,半贴壁生长的细胞容易脱离。假如药物作用时间长的话,阴性对照组可能由于细胞过多而使加入后形成的结晶漂起来,这样就不能直接倒掉上清。4.做MTT时,这一步骤一定要小心,不要采用倒的方式。因为贴壁不牢的细胞会被倒掉,从而影响OD值。悬浮细胞,不要翻板,离心后也不要翻板,这个方法害死人。5.加完MTT反应34h后,从培养箱取出96孔板的动作要轻柔,避免振荡结晶,使其滑落.你可以试着将96孔
16、板倾斜30度角,然后用枪尖慢慢吸,有的细胞可以用排枪一起吸,有的则要耐心的一个个用枪头吸,枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致。不要让枪头接触到孔底,且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平,这样也会使结晶脱落。6.用医用的注射器加上针头吸取液体的,吸取时要把板子斜放,沿着壁吸取就好了!这次MTT我用1ml针头仔细吸培养液,觉得比其它方法可靠,一般不会吸走紫色结晶.避免清除上清而改进的方法由于一般可离心96孔板的离心机不好找。既使是贴壁细胞做MTT时,用DMSO溶解得到结果也不好,不是得不到预期结果就是可重复性差。解决方法1:用以下文献方法:周建军等,评价抗癌物质活性的改良MTT方法,中国医药工业杂志,1993,24(10):455-457具体方法:配三联溶解液:10%SDS,5%异丁醇,0.012mo