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1、放射免疫分析,第1讲 放射免疫分析 的概念和产生,放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)是最早的一种标记免疫分析，通过放射性示踪物观察抗原与抗体的结合反应产物测定微量物质。,1952年I.A. Mirsky提出老年性糖尿病可能不是因为胰岛素分泌不足引起的，而是由于肝胰岛素酶降解胰岛素的速度加快引起的。,为了验证这种观点，S.A. Berson和R.S. Yalow等人(1956)给非糖尿病和糖尿病受试者静脉注射131I标记胰岛素以研究其代谢，他们比较了接受胰岛素治疗的病人和从未接受过胰岛素的受试者的血浆，发现前者胰岛素的消失速度比后者慢得多，提出外源胰岛素的注射使病人体内产生
2、了抗体，与抗体的结合导致胰岛素消失速度降低。,由于胰岛素抗体的浓度太低，用以往的免疫学技术不能测定，因此Berson和Yalow等人采用放射性标记法测定浓度极低的抗原-抗体复合物。电泳结果表明在接受胰岛素治疗的病人的血浆中，胰岛素与一种球蛋白结合，证明胰岛素抗体确实存在。,值得一提的是，在20世纪50年代中期，免疫学家还不能接受“胰岛素抗体”这一概念。Berson和Yalow等人的论文被Science退稿，刚开始投Journal of Clinical Investigation(JCI)也是退稿，后来向JCI的编辑作出妥协，从标题中删去“胰岛素抗体”字样，论文才得以在JCI上发表。,Bers
3、on和Yalow等人的工作引发了免疫学上的一场革命。现在普遍认为一些小分子量的多肽如后叶加压素和后叶催产素也可以是抗原。,在方法上，Berson和Yalow等人提出：当抗体已定量时，标记胰岛素和抗体的结合与非标记胰岛素的浓度成函数关系，这就为血浆胰岛素的放射免疫分析提供了基础。,在随后的几年中，他们又做了一些研究工作，包括胰岛素与其抗体反应的定量和可得抗血清的物种特异性等，这些必要的工作使放射免疫分析由理论转变为实践，于1959年首次完成人血浆(不进行抽提)胰岛素的测定。,RIA具有技术简易、价格便宜、特异性强和灵敏度高等优点，广泛用于生物医学研究和临床诊断。到20世纪60年代晚期，RIA已成
4、为一项重要的分析技术。,据估计，在1975年的一年之中，全美进行RIA的临床实验室有4000个以上。Yalow因此荣获1977年Nobel生理学或医学奖(遗憾的是，Berson于1972年因心脏病逝世，未能共享殊荣)。,第2讲 放射免疫分析 的原理和特点,当抗体初始浓度Ab0低于标记抗原初始浓度Ag*0和非标记抗原初始浓度Ag0之和时，非标记抗原Ag将与标记抗原Ag*竞争结合抗体Ab，分别生成非标记抗原-抗体复合物Ag-Ab和标记抗原-抗体复合物Ag*-Ab。,当Ab0和Ag*0都已确定时，如果Ag0低，则生成的Ag*-Ab多(其浓度B高)，剩余的标记抗原Ag*少(其浓度F低)，B/F值较高；
5、相反，如果Ag0高，则B低，F高，B/F值较低。,在测定时，Ab0和Ag*0都是已知的。以B/F值为纵坐标，以标准溶液非标记抗原初始浓度为横坐标制作标准曲线，得到回归方程，在相同条件下测定未知非标记抗原的B/F值，即可用回归方程求得未知非标记抗原的初始浓度。,根据加样顺序与温育次数的不同，放射免疫分析可分为如下三种。 平衡法：将非标记抗原、抗体、标记抗原依次加入反应管，混匀后一次性温育至反应达到动态平衡，再加分离剂使B与F分离。,顺序加样法：先将非标记抗原与抗体在反应管内作第一次温育，待反应达到动态平衡后，加入标记抗原，作第二次温育，然后分离B与F。,急诊检测法：为临床上快出结果而提出的反应方
6、式，不等RIA反应达到动态平衡就终止反应。,放射免疫分析巧妙地结合了抗体抗原反应的高特异性和放射性核素标记的高灵敏度。RIA的灵敏度极高，可检出0.1 pg/ml(0.05 pM)的胃泌激素。,相比之下，受体位点分析(receptor site assay)的最低检出浓度一般至少是RIA的10-100倍。 酶标记分析(enzyme marker assay)由于作为标记的酶分子与抗原共价连接，抗原-抗体反应存在空间阻碍，分析灵敏度的降低几乎不可避免。,第3讲 放射免疫分析的发展,第1代(1959-1964)：Berson和Yalow等人于1959年首次提出了竞争抑制免疫反应原理，创建了RIA技
7、术检测人血浆胰岛素的水平。1960年，Ekins根据RIA相同原理，以某些天然特异性蛋白作结合剂，建立了竞争结合蛋白分析法(CPBA)检测血浆中的甲状腺素、甾体类激素等小分子半抗原。因操作程序比较复杂，难以应用到临床样品的常规检测。,第2代(1965-1970)：RIA技术的独特优势受到生物医学研究者的高度关注，许多学者对这一新的检测技术进行了大量方法学的研究，在抗原-抗体复合物和游离标记抗原分离方法上取得了满意的结果，简化了实验程序，将RIA和CPBA技术推进到了临床实用水平，为建立试剂盒产业化生产提供了条件。,第3代(1971-1980)：1970年Brown等人将三碘甲腺原氨酸(T3)和
8、聚赖氨酸以共价键偶联制成结合物(T3-PLL)，免疫动物获得T3抗体，打破了半抗原不能制备出抗体的论断，1971年Chopra首次完成了血清T4 RIA方法的建立。从此，RIA完全取代了CPBA检测小分子化合物，扩大了RIA技术应用范围，推动了RIA试剂盒产业化的发展。,第4代(1981-1995)：早在l975年，Milstein和Kshler将绵羊红细胞注射给小鼠，将获得的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，得到了杂交细胞，经培养、分离、成株等系列步骤后，首次制备出小鼠抗绵羊红细胞的单克隆抗体(mAb)。这一重大研究成果为RIA及其他免疫分析技术提供了新型特异性抗体。进入20世纪80年代，mAb制
9、备技术的完善和许多固相载体材料的研制成功，将试管固相、塑料球等包被mAb制成固相抗体，传统IRMA技术的灵敏度、特异性和检测量程度提高到了一个新水平。,第5代：近年来，磁性微粒子在标记免疫分析中的应用迅速，它是在磁性活性炭和磁性微球的基础上发展起来的。磁性微粒子和磁性微球主要差别是直径的大小和均一性。前者直径为800-2000 nm，均一性良好，在液体中具有较高的悬浮性，而磁性微球则否。磁性微粒子表面带有活性基团，如-CONH2、-NH2和-COOH等，经偶联剂以共价键结合抗体制成磁性固相抗体。其包被量大、均一性高、牢固性强等特点是物理吸附难以比拟的。磁性微粒子固相抗体或固相亲和素首先应用于C
10、LIA试剂盒的制造，最近也应用于IRMA和RIA。,(1)液相双标记IRMA技术：将两株mAb分别标记125I和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothicyanate，FITC)作为标记试剂，检测时将样品和标记试剂加至试管中，温育后加入磁性固相抗FITC，5 min后，置于磁性分离器上，洗涤后即测量放射性。抗原和标记抗体在液相中反应生成双抗体夹心复合物，免疫反应达到平衡所需时间比固相试管法更短，各项技术参数均超过目前广泛采用的IRMA法。,(2)磁性固相第二抗体RIA竞争法：这一免疫反应模式实际上是一种新型的磁性二抗分离技术，有两种不同的第二抗体可制成磁性固相供快速分离。一种是制备
11、抗第一抗体的二抗磁性微粒子固相作分离剂，另一种是将第一抗体IgG标记FITC、抗FITC抗体和磁性微粒子结合作为分离剂，两种分离剂检测结果高度一致。与常规试剂盒相比，优点是不必加复合二抗分离剂以及离心沉淀分离步骤，简化了程序，缩短了时间，提高了精密度。,(3)磁性第一抗体固相RIA竞争法：此种免疫反应模式是将第一抗体制成磁性微粒子固相，检测程序较磁性第二抗体分离剂法更简便，可一步完成。只需将样品、125I标记抗原和磁性微粒子固相抗体加至塑料管中，温育后置磁性分离器上倾出上清液，经一次洗涤后即可测量放射性强度。在实验研究中发现，此模式非特异结合过高，而操作人员又很难发现，从而降低了检测技术的灵敏
12、度和精密度，影响测值的准确性。,(4)自身抗体快速检测法：许多临床常见病、多发病的发病机理与自身免疫状态关系密切，如甲状腺疾病、糖尿病和系统性红斑狼疮等，检测相关自身抗体对临床诊断及疗效判断是一种有价值的指标。采用磁性微粒子RIA技术，具有简便、快速、特异性高等优点，其原理是血清中的抗体和125I-抗原混合温育，生成抗原-抗体复合物，然后反应液中加入抗人IgG磁性微粒子分离剂5 min，置于磁性分离器上，弃上清液，测放射性。放射性强度与血清中自身抗体量呈正比。,(5)生物活性肽IRMA法：生物活性肽是一类分子量为(2-4) 103的肽类，参与多种生理生化代谢和互相调节过程，检测这类物质水平对研
13、究心脑血管疾病的发生、发展及防治具有重要意义。最近的实验研究表明，生物活性肽在人血浆中以多种形式存在。既有前体物又有降解产物的片段，目前检测这类化合物采用多抗RIA竞争法，抗体和降解物片段有不同程度的免疫反应，测值为待测物和降解物的总和，称为免疫反应样物质，不能表示待测物的真实浓度。随着肽合成技术的完善和mAb制备方法的改进，已可由生物制品公司提供肽的N端和C端肽类化合物片段及相应的mAb，使建立生物活性肽IRMA技术成为现实。研究者应用这一新的技术研制的人血清C-肽磁性微粒子RIA试剂盒，其各项方法学指标超过目前市场上的产品水平。,具有类似原理的其他分析方法,免疫放射分析(IRMA) 标记的
14、是抗体，分为如下两种。 单位点IRMA：抗原为小分子抗原，只有一个抗原决定簇，见下页图。,上图中ImAd-Ag为固相抗原免疫吸附剂，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗原。,双位点IRMA：又称双抗体夹心法，抗原有两个抗原决定簇，所用的两种抗体在与同一抗原结合时互不干扰，见下页图。,上图中ImAd-Ab为固相抗体免疫吸附剂，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗体。,从加样顺序来看，双位点IRMA分为如下三种。 正向两步法：待测抗原先与固相抗体结合，再与标记抗体结合，然后去除游离的标记抗体，测固相抗体-抗原-标记抗体复合物的放射性计数。,反向两步法：待测抗原先与标记抗体结合，再与固相抗体结合，然后去除游离的标记抗体
15、，测固相抗体-抗原-标记抗体复合物的放射性计数。,一步法：又称同时加样法，待测抗原与固相抗体和标记抗体同时反应，然后去除游离的标记抗体，测固相抗体-抗原-标记抗体复合物的放射性计数。,放射受体分析 3H标记的四环素可与样品中四环素类药物竞争结合特异性受体，当样品中残留有四环素类药物时，残留药物与受体结合，从而阻止了标记四环素与受体的结合。样品中的四环素类药物含量越高则结合的受体越多，而标记四环素结合的受体越少。,第4讲 放射免疫分析的应用,RIA除了用于测定胰岛素、胃泌激素外，还被用于测定维生素B12和甲状腺素等。在临床上，用放射免疫分析可检测2-微球蛋白和铁蛋白等。可用RIA测定的物质如下：
16、 一、肽类激素 垂体激素：生长激素、促肾上腺皮质素、促黑激素(-促黑激素、-促黑激素)、糖蛋白类(促甲状腺素、促卵泡激素、促黄体激素)、催乳素、促脂素、加压素、催产素 绒毛膜激素：人绒毛膜促性腺激素、人绒毛膜生长促乳素 胰腺激素：胰岛素、胰高血糖素、胰多肽,趋钙激素：甲状旁腺素、降钙素 胃肠激素：胃泌素、促胰液素、缩胆囊肽、血管活性肠多肽、胃抑制多肽 血管活性组织激素：血管紧张素、缓激肽 释放抑制因子：促甲状腺素释放激素、促黄体激素释放激素、促生长素抑制素 其他肽：P物质、内啡肽、脑啡肽,二、非肽类激素 甲状腺激素：甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、反三碘甲腺原氨酸 类固醇：醛固酮、皮质类固醇、雌激素、雄激素、孕酮 前列腺素 生物胺：5-羟色胺、褪黑激素,三、非激素物质 药物与维生素：强心苷、滥用药物、精神活性药物、抗生素、中枢神经系统抑制剂、维生素A、叶酸 环核苷酸 酶：C1酯酶、果糖1,6-二磷酸酶、纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、碳酸酐酶同工酶、醛糖还原酶、羧肽酶、胰弹性蛋白酶,病毒：肝炎相关抗
