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1、抗呕吐毒素多克隆抗体的制备、 纯化及鉴定 作者：张银志, 王俊双, 孙秀兰【摘要】 目的: 制备呕吐毒素（DON）的多克隆抗体, 并对抗体效价、 特异性和抑制率进行鉴定。方法: 采用EDC法合成了呕吐毒素的完全抗原DONBSA, 并通过免疫新西兰大白兔, 得到呕吐毒素的多克隆抗体。结果: ELISA检测出多抗中含有呕吐毒素的特异性抗体, 其效价最高为12 800, 其抑制率为50%时, DON的浓度为10 mg/L, DON的最低检测浓度为0.1 mg/L。与结构类似物T2毒素和NIV的交叉率分别为9.1%和4.9。结论: 呕吐毒素经过衍生化后制备出完全抗原, 经免疫新西兰大白兔后得到的多克隆
2、抗体可以完全满足ELISA检测的需要。 【关键词】 呕吐毒素; 多克隆抗体; 鉴定呕吐毒素(vomitoxin)又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol; DON)1, 化学名为3, 7, 15一三羟基草镰孢菌9烯8酮, 属单端孢霉烯族化合物。DON主要由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）和黄色镰刀菌（Fusarium culmorum.）产生, 广泛存在于霉变的小麦、 大麦、 玉米等谷物籽实中, 具有急性毒性、 免疫毒性和胚胎毒性等危害2-4。目前国内关于DON的检测方法, 主要包括薄层层析法(TLC)、 高效液相色谱法(HPLC)、 气相色谱法(GC)、 L
3、CAPCIMS和免疫学检测方法。免疫学检测方法具有特异性强、 灵敏度高、 实验操作较简单等优点, 广泛应用真菌毒素检测。目前国内有少数几家公司生产用于检测呕吐毒素的ELISA试剂盒, 但生产中的主要试剂DON的完全抗原和多克隆抗体基本来自于国外, 价格昂贵。我们在本实验室合成了DON免疫抗原和检测抗原的基础上, 制备了DON多克隆抗体, 对抗体效价和特异性进行检测, 研究结果为建立呕吐毒素的免疫检测方法奠定了基础。1 材料和方法1.1 材料 酶标仪、 洗板机和可调试移液器为Thermo Labsystem公司; 冷冻离心机为 Allegra公司; 冷冻干燥机为Labconco公司; 微量可调移
4、液器: Finnpipette 公司; 96孔和16孔酶标板: Corning公司。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON) 、 弗氏不完全佐剂( ICFA) 、 弗氏完全佐剂( CFA) 、 牛血清白蛋白(BSA) 、 卵清蛋白(OVA) 均购自于Sigma公司; 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（HRPIgG）、 1乙基3(3二甲氨丙基) 碳二亚胺盐酸盐(EDCHCl)四甲基联苯胺（TMB）上海生工生物技术服务工程公司; Tween20 国药集团化学试剂有限公司。透析带(截留分子量14 000)为上海华美生物工程有限公。新西兰长耳白兔（雄性, 1.52.0 kg）购自上海陈行实验用兔有限公司。1.2
5、方法1.2.1 完全抗原的制备 （1）分别称取DCC 0.78 mg、 NHS 1.38 mg, 并分别溶于100 L的 DMF 中, 待用。（2）分别称取4 mg BSA和 MBSA 溶于200 L, 0.01 mol/L pH7.4 PBS中, 冰箱中冷藏待用。将DON 衍生物溶于350 L的 DMF 中, 将 NHS 溶液加入, 并在搅拌的同时缓慢加入DCC溶液, 混合物在4避光反应2 h, 经离心提取上清夜, 然后在搅拌的同时缓慢滴加 BSA（或MBSA）溶液, 4下缓慢搅拌反应20 h。（3）将产物溶液用0.01 mol/L pH7.4 PBS 溶液在4下透析72 h, 每12 h换
6、透析液1次, 溶液用小瓶分装, 真空冷冻干燥后, 在4保存。制备包被抗原所用的蛋白为OVA, 方法与免疫抗原相同5-8。1.2.2 抗血清的制备 选3只健康新西兰雄性大白兔, 取其中1只作为阴性对照, 剩余2只为实验组。初次免疫时, 将DONBSA冻干粉用生理盐水溶解, 用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量, 配成1 g/L的溶液。将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其充分乳化好后, 于实验动物背部皮下多点注射, 1 mL/只。初次免疫后的免疫称为加强免疫, 加强免疫用福氏不完全佐剂乳化, 第1次加强免疫于足下注射, 以后的加强免疫于肌肉多点注射, 每2周加强免疫1次, 剂量与初次
7、免疫相同。第2次加强免疫后, 每隔2周耳缘静脉取血测定效价变化, 4次加强免疫后从耳缘静脉采血, 采用间接酶联免疫法测定抗血清效价。待效价达到要求后, 单独用免疫原冲击免疫1次, 7 d后采用颈动脉取血获得抗血清, 收集于50 mL灭菌塑料离心管中, 备用。1.2.3 纯化 塑料离心管倾斜, 与水平成50于室温下静置4 h, 待血液凝固后, 于4冰箱过夜, 血清自然析出。将血清吸出后, 3 000 r/min离心15 min, 取上清, 与前面吸出的血清混在一起, 再以4 000 r/min离心10 min, 然后加入0.2 g/L叠氮钠和500 mL/L甘油, 分装, -20保存备用。1.2
8、.4 效价测定 采用饱和硫酸铵二次沉淀法纯化抗体9。1100稀释 DONOVA包被液, 100 L/孔, 4冰箱过夜; 弃去包被液, 每孔注入200 L洗液, 于振荡器上振荡3 min, 如此重复洗涤3次; 拍干酶标板, 每孔加入150 L溶液封闭酶标板, 37 封闭2 h; 洗涤3次, 按100 L/孔加入抗血清（或DON抗血清的混合物）, 37孵育1 h; 弃去抗血清洗涤3次, 拍干, 加入酶标二抗, 100 L/孔, 37孵育1 h; 弃去酶标二抗, 洗涤3次, 每孔加入100 L底物显色溶液, 37避光15 min; 每孔加入终止液50 L, 测定450 nm的吸光度值(A450)。间
9、接 ELISA 法测定抗血清的效价, 将抗血清和阴性对照血清进行逐级稀释, 空白对照孔不加抗血清而加入100 L PBS 溶液。阳性血清的A450阴性对照孔的2.1倍并且A450大于0.1, 此时的抗体稀释倍数即是该抗血清的效价。1.2.5 抑制浓度IC50和交叉反应率的测定 （1）用 PBS 将 DON 标准品稀释成不同浓度（1 000、 100、 10 、 1、 0.1、 0.01 mg/L）标准液, 将标准液和适当浓度的抗血清混合, 吸取混合液100 L按照 ELISA 进行测定。以（1A/A0）100接近 50时的混合液中的DON标准浓度作为IC50。（2）以不同浓度（1 000、 1
10、00、 10、 1、 0.1、 0.01 mg/L）的DON的近似物 T2 毒素替代DON, 按照 ELISA 进行测定分别得到各自的抑制浓度 IC50, 以DON的IC50除以近似物T2毒素的 IC50得到交叉反应率（IC50/IC50100）, 根据交叉反应率的大小反映抗血清的特异性。2 结果2.1 DON人工抗原的鉴定 （1）从 IR图谱（图1）中可以看出, 谱带 1、 2、 3 存在差异。BSA的红外光谱显示了蛋白质所共有的谱带, 3 315 cm-1为胺基伸缩振动产生, 1 651 cm-1和1 538 cm-1为酰胺带和酰胺带。DONBSA偶联物的红外光谱图基本显示出BSA的特征吸
11、收谱带, 但与 BSA 相比, 偶联物在1 070 cm-1和1 024 cm-1（CO键的吸收）处显示出了明显的吸收峰, 这与 DON 标准品在这两处的吸收相吻合。而呕吐毒素的衍生物结构中的有些特征基团如1 735 cm-1的丁酮（羰基C=O）, 由于受BSA吸收峰的影响表现并不明显。（2）ELISA检测法: 为了进一步证明DON完全抗原的存在, 用ELISA法进行2次检测。从表1中的数据可以看出, 与呕吐毒素的标准溶液相比, 在酶联免疫反应中呕吐毒素的完全抗原表现出了相同A值变化趋势, 可以证明偶联是成功的。图1 DONBSA偶联物红外光谱图（略）2.2 抗血清的鉴定 （1）抗血清效价的确
12、定: 第2次免疫1周后, 兔耳缘静脉取血测定抗血清的效价, 以后每隔3周取血测定1次, 直到动脉完全采血, 抗血清效价的变化如图2所示, 从图2可以很明显看出, 免疫动物抗血清的效价呈不断升高的趋势, 最后1次免疫取血抗血清效价明显提高, 表明完全抗原的免疫性较好。由于收集到的血清中存在一些非特异性的物质, 故需要将抗血清纯化后再进行效价测定。对纯化前后测定抗血清的效价做了比较, 从结果可以看出, 纯化后抗血清的效价要明显好于纯化前的血清。（2）抗血清效价的测定:采用间接ELISA测定抗血清的效价, 1号、 2号两只兔子抗血清的效价分别为12 800和1 600。表1 呕吐毒素完全抗原ELIS
13、A检测数据（略）图2 几次采血后的抗血清效价的测定（略）2.3 多克隆抗体特性鉴定 图3显示, DON的浓度在0.1 mg/L至100 mg/L之间与A/A0有良好的线性关系。截取DON浓度在0.1 mg/L至100 mg/L之间, 以吸光度比值A/A0为纵坐标, 1 000倍DON标准溶液的浓度的对数值为横坐标拟合标准曲线, 得到线性回归方程为: Y=-0.2134X+1.3463, R2=0.9962。以A/A0值接近50%所对应的DON 的浓度为IC50, A/A0值接近50%时, DON的浓度为10 mg/L, 即本实验方法所得IC50值为10 mg/L。该值恰好位于标准曲线的线性区间
14、上。 同时研究了DON的两种结构类似物T2毒素、 雪腐镰刀菌烯醇NIV对抗血清的竞争抑制反应性, 结果显示, T2 毒素代替DON所得IC50为110 mg/L、 NIV代替DON标准溶液所得IC50为204 mg/L , DON与T2毒素、 NIV的交叉反应率分别为 9.1%, 4.9%。图3 抑制率曲线（略）3 讨论 DON的相对分子质量仅为296.3, 属于小分子半抗原, 有免疫反应性, 无免疫原性, 只有将其与大分子载体蛋白偶联, 才能作为免疫原。可用的载体蛋白有BSA、 兔血清白蛋白（RSA）、 牛甲状腺球蛋白（BTG）以及OVA等, 其中以BSA、 OVA最为常用43为了减缓免疫原
15、在动物机体内的释放速度, 延长免疫原具有免疫活性的时间, 在免疫前必须将免疫原与佐剂乳化完全, 形成油包水的结构。 据呕吐毒素本身的结构特性, 需要用化学方法在呕吐毒素上引入羧基后才能与载体相连, 然后应用碳二亚胺法合成完全抗原, 该法可分为两种, 一种是在有机相中进行反应的二环已基碳二亚胺法 (DCC法), 另一种是在水相中进行反应的对乙基一N, N一二甲基丙基碳二亚胺法(简称EDC法)。我们采用DCC法进行合成, 合成过程中需要在严格的无水条件下进行反应, 所用的有机溶剂需预先脱水处理。 本实验得到的呕吐毒素的抗原和多克隆抗体经ELISA鉴定后完全符合ELISA检测的要求, 不仅为建立呕吐毒素ELISA和金标侧流层析（CGIA）等检测法奠定了基础, 同时也可以用于基于免疫抗体识别分析的DON的相关研究中。【参考文献】 1 刘绍伟, 罗仕欢. 浅谈霉菌呕吐毒素J. 湖南饲料, 2006(2): 26-27.2 阳传和, 刘 畅, 罗雪云, 等. 小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇酶联免疫吸附测定方法的研究J. 微生物学报, 1994, 34(1): 65-70.3 李国华, 陆曙梅. 免疫检验技术M. 北京: 人民卫生出版社, 2002, 125.4 梁 颖, 张春晖, 刘
