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1、鸡副嗜血杆菌的分离与鉴定摘要：鸡副嗜血杆菌可以引起鸡传染性鼻炎（IC），以鼻炎和鼻窦发炎、结膜炎、流鼻涕、打喷嚏、面部肿胀为主要症状。对养禽业带来重大的经济损失。本文根据细菌的分离培养、形态观察、血凝试验、易感动物回归试验及 PCR鉴定对副嗜血杆菌进行分离与鉴定。关键词：鸡 副嗜血杆菌、分离、鉴定自20世纪80年代以来，许多国家和地区均有爆发鸡副嗜血杆菌病的报道，且近期鸡副嗜血杆菌的发生率呈上升趋势，它是集约化养鸡场中重要的疫病之一。鸡副嗜血杆菌可以引起鸡传染性鼻炎（IC），以鼻炎和鼻窦发炎、结膜炎、流鼻涕、打喷嚏、面部肿胀为主要症状。本病多见于雏鸡群和产蛋鸡群，造成淘汰鸡数显著增加以及产蛋率
2、显著下降，同时易引起流感或新城疫的并发，造成鸡场的重大经济损失。副鸡嗜血杆菌 (Haemophilusparagallinamm，Hpg)是一种引起鸡急性上呼吸道疾病的致病菌。该呼吸道疾病俗称鸡传染性鼻炎 (Infectiouscoryza，IC)，临床上 以面部水肿、鼻窦炎、流泪为主要特征 ，可引起产蛋鸡的产蛋量下降 ，育成鸡的生长受阻、开产期推迟，肉鸡增重下降，给养禽业造成巨大的经济损失1,2。1920年，Beach首次对鸡传染性鼻炎进行了报道。1931年，DeBlieck成功分离了病原。自20世纪 80年代以来，在我国河北、北京、云南、山东 、湖北等省市先后爆发鸡传染性鼻炎。冯文达于 1
3、987年首先在北京分离到 1株细菌 ，证实了副鸡嗜血杆菌在我国的广泛存在3。按照 Page的分型方法，通过平板凝集试验可将副鸡嗜血杆菌分为 A、B和 C3个血清型4。乔朋波5 研究表 明不同血清型的副鸡嗜血杆菌在生长特性、致病性、药物敏感性和外膜蛋白结构等方面均存在差异。目前，在我国副鸡嗜血杆菌以 A型和 C型菌株 的流行为主，部分地区己经有 B型株的存在6。流行于我国的不 同血清型副鸡嗜血杆菌的先后有分离与鉴定的报道。研究表明，相同血清型间有交叉保护作用 ，不同血清型之间无交叉保护作用7,8。1. 鸡副嗜血杆菌的生物学特征1.1形态特征和培养特性鸡副嗜血杆菌为革兰氏阴性菌，呈两极染色特性，无
4、运动性，经24 h培养，生长成短杆状或球杆状，单在、成双或短链，长13 m，宽0.40.8 m。有毒力的菌株带有荚膜。本菌在含10%CO2条件下，血琼脂培养基上于37培养2448 h，发育成青灰色、半透明、光滑、边缘整齐、直径约0.3 mm的针尖状菌落，不溶血，在斜射阳关下可见光滑型带彩虹光和粗糙型无彩虹光型的菌落形态。本菌为兼性厌氧菌，需要V因子，葡萄球菌在生长过程中产生V 因子。把鸡副嗜血杆菌与葡萄球菌接种在同一血液琼脂上，可在葡萄球菌菌落周围发现旺盛生长的鸡副嗜血杆菌，形似“卫星”状。本菌是唯一不能发酵海藻糖、半乳糖，有氧化氢酶阴性的嗜血杆菌。1.2 抗原性和抵抗力该菌分成A、B、C 3
5、个血清型。A和C 型有夹膜，致病力较强；B 型无夹膜，致病力一般较弱。不同血清型之间无交叉保护力，同一血清型的不同亚型之间有部分交叉保护力。目前，我国分离鉴定的鸡副嗜血杆菌主要是A 型，其次为C 型，B型偶有发生。副嗜血杆菌在离开鸡体后抵抗力非常弱。培养基上的细菌在4时能存活2 周，在自然环境中数小时即死亡；4555于210min死亡，在真空冷冻条件下可以保存10 年。一般消毒药均能将其杀死。2.感染鸡副嗜血杆菌的流行病学、症状与病理变化鸡是副嗜血杆菌的自然宿主，病原菌由鼻孔侵入，主要在鼻腔和眶下窦的黏膜上增殖，并随鼻液排出。各种周龄的鸡均易感，初产蛋鸡最敏感，病程一般为12周。传染源为病鸡和
6、隐性带菌鸡，主要通过空气和尘埃，也可经污染的饲料、饮水用具、饲养人员的流动而传播。本病潜伏期很短，鼻腔接种病鸡分泌物2448 h即发病。自然感染潜伏期为13 d。最初，病鸡无明显症状，仅见鼻中有稀薄水样鼻液，打喷嚏。几天后大批鸡感染，发病率可高达90%以上。成鸡鼻腔内流出浆液性或粘液状分泌物，堵塞鼻孔而出现呼吸困难和甩头。随后面部发炎，眼肿胀流泪，有脓性干酪样分泌物堆积。严重的整个头部肿大，失明。雏鸡发病常见张口呼吸，眼睑粘着，多因觅食和行动困难而饥饿、衰竭死亡，幸存雏鸡发育停滞或增重缓慢，淘汰率一般在30%以上。蛋鸡除表现成鸡症状外，开产期延迟，产蛋量下降。剖检可见鼻腔、眶下窦和眼结膜的急性
7、卡他性炎症变化，面部及肉垂的皮下水肿。病程较长的可在气囊、腹腔和输卵管内见有乳黄色干酪样分泌物。产蛋鸡卵泡松软、血肿、坏死或萎缩，腹膜炎，公鸡睾丸萎缩。病理组织学检查，可见鼻腔、眶下窦和气管黏膜上皮细胞脱落、裂解和增生，黏膜固有层充血、水肿并伴有异染性细胞浸润。3.材料与方法31 主要试剂 含辅酶 I的鸡 肉汤琼脂平板、兔全血平板、麦康凯琼脂、巧克力琼脂平板、革兰氏染色液等，均为 自制 ；dNTP、PCRburet、TaqDNA聚合酶、DNAMarkerDL2000、均购自生工生物丁程(上海)有限公司；其他试剂 ，均为分析纯。32 细菌的分离培养和镜检用灭菌的棉签蘸取病鸡眼睑、鼻窦分泌物 ，接
8、种于血平板 ，于 37qC培养箱中培养 48h后观察菌落。若出现疑似的单个菌落，进行纯化培养。挑取单个菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌的形态特 征 。以无菌拭子采集24月份急性发病鸡眶下窦分泌物，也可采取气管或气囊分泌物，在鸡血琼脂平板上划线，然后再以葡萄球菌（能产生V因子）作为“饲养菌”在平板上交叉划线，置于带螺丝盖的大光口蜡烛瓶中于37培养，蜡烛自行熄灭。33 卫星现象观察3 取鲜血平板 ，培养基的平皿 ，一个划线接种所分离纯化 的、疑似副鸡嗜血杆菌细菌，并点种分离的金黄色葡萄球菌 ，于 5CO，培养箱中 37培养 48h，观察其是否在葡萄球菌周围长出“卫星现象”。34 血凝试验
9、 挑取菌落用生理盐水稀释，振荡均匀后制成菌体悬液。在载玻片的一端，滴加菌体悬液 50 l，另一端加入 50 l生理盐水 ，两端再各加入 50 ll鸡血红细胞 ，轻轻晃匀。在温箱内反应 3min左右后，观察结果。35 引物设计参考已发表的副鸡嗜血杆菌基因序列8，设计并合成 1对引物：N1：5一tgagggtagtcttgcacgcgaat一3：R1：5，-caaggtategatcgtctctctact一3，扩增片段大小为464bp。36 PCR鉴定挑取纯化培养的单菌落接种于 3Inl营养肉汤中，5CO：培养箱 37培养48h。按照煮沸法，提取菌液 DNA为模板，以大肠杆菌 DNA为对照，进行
10、PCR。PCR反应体 系(25 1)：mix125 l，ddH，055 ，Nll l，R1lIxl，DNA模板 5 l。PCR反应条件为：95预变性 5min：9530S，59cc30S，72oC45S，共 35个循环 ；72延伸 10arin。将 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。37 动物回归试验 从某鸡场购买 6只 90日龄育成鸡(无传染性鼻炎疫苗接种史和发病史)。3只眶下窦接种分离菌株的肉汤培养物 01ml(约 210。个细菌m1)，另外 3只眶下窦接种肉汤作为对照。然后 ，每 日观察临床症状 ，对出现典型症状的鸡，采集眶下窦分泌物于全血平板上分离培养。4.结果与分析41细菌分离情况病
11、鸡鼻窦和眼睑分泌物在麦康凯琼脂巧克力琼脂平板上 ，均无菌生长。在辅酶 I的肉汤琼脂上和全血平板上生长灰 白色、边缘整齐、表面光滑、有轻度隆起、粘液状、湿润、有光泽、不透明的菌落。挑取菌落涂片，染色、镜检，可见有大量的单个、成对或短琏的两极浓染的革兰氏阴性细小杆菌9。42卫星现象在葡萄球菌交叉划线 的固体培养基上，37培养 48h，在葡萄球菌周围有明显的“卫星现象”。43PCR鉴定结果应用副鸡嗜血杆菌特异性引物进行PCR扩增 ，从分离菌株扩增 出464bp大小的条带，与 目的片段大小一致 ，而大肠杆菌没有扩增出特异性条带，证实该分离株为副鸡嗜血杆菌。44血凝活性 经观察，鸡血红细胞未出现凝集现象
12、，该分离株没有血凝性。这说明分离株为 c型副鸡嗜血杆菌。鸡副嗜血杆菌的3种血清型具有共同抗原，用一种血清型菌株制备的凝集抗原可用于检测3种血清型的抗体。应用平板或试管凝集试验，在感染本病后714 d可检出副嗜血杆菌凝集素。应用琼脂扩散试验，在感染或免疫后2周可检出抗体并至少持续11周。应用血凝抑制试验可检出与保护性免疫密切相关的血清型特异的抗原抗体。45动物回归试验将该株分离菌接种易感鸡 24h后 ，3只接种鸡均 出现食欲减少 ，脸部和眼睑部水肿流泪、流水样鼻汁。从人工感染鸡 的眶下窦 中分离 ，经 PCR鉴定为副鸡嗜血杆菌。对照组既没有出现症状 ，也没有从眶下窦分离到副鸡嗜血杆菌。5讨论副鸡
13、嗜血杆菌是引起鸡传染性鼻炎的致病菌，可引起感染鸡群严重的上呼吸道疾病。副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌病原引起 的疾病在流行病学、临床症状上较 为相 似，易混淆6-10。一般情况下通过病原的分离与鉴定就可以确定病因，但是副鸡嗜血杆菌的生物学特性较为复杂 ，对培养条件的要求苛刻 ，在培养过程中需加入辅酶和血清等，常规生化鉴定操作耗时费力，而且容易污染。根据细菌的分离培养、形态观察、血凝试验、易感动物回归试验及 PCR鉴定结果，初步证实了从疑似鸡传染性鼻炎的病鸡分离的菌株为 c型副鸡 嗜血杆菌。，大多种鸡场都进行传染性鼻炎疫苗 的免疫，但是商品鸡较少进行免疫11-12。，分离的副鸡嗜血杆菌不具有血凝性，初步
14、确定为 c型副鸡嗜血杆菌13。参考文献1SAIFYM，BARNESHJ，FADLYAM，eta1DiseasesofplryM1ltheditionIowa：IowaStateUniversityPress2003：6917032POERNOMOS，SUTARMA，RAFIEEM，eta1CharacterisationofisolatesofHaemophilusparagallinarumfromIndonesiaJAustVetJ，20OO，78(11)：7597623冯文达北京鸡传染性鼻炎病原菌的分离鉴定J微生物学通报 ，1987，(5)：2162194史丽华锦州地区鸡传染性鼻炎的流行
15、病学调查J畜牧与兽医，2010，42(6)：81835乔朋波不同血清型副 耆血杆菌差异的比较 D保定：河北农业大学 ，201I6朱士盛 ，王薪青岛地区鸡传染性鼻炎病原株的分离鉴定与定型研究J中国动物检疫，1994，11(4)：687史雪萍，周国政，马凤龙，等鸡传染性鼻炎的病原诊断与防治J莱阳农学院学报 ，2005(3)：2132158MOUAHIDM，BISGAARD M W，MORLEYETALAJOccurrenceofVfactor(NAD)independentstrainsofHaemophilusparagallinarumJVeterinaryMicorbiology，1992，31：3633689宋程 ，陈小玲 ，陈葵用 PCR诊断鸡传染陛鼻炎的进一步研究J中国兽药杂志，1998，32(4)：1310林毅，张道永，王文贵鸡传染 睦鼻炎的病原分离鉴定及防制J中国兽医科技 ，1995，25(1)：20 2111苗得园，引感 玲，陈晓峰，等副 耆血杆菌的分离鉴定及我国鸡传染性鼻炎的流行状况分析 J中国预防兽医学报，2006，28(4)：39239512
