川明参多糖质量控制方法及相关药效学研究

《川明参多糖质量控制方法及相关药效学研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《川明参多糖质量控制方法及相关药效学研究（63页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、成都中医药大学 硕士学位论文 川明参多糖质量控制方法及相关药效学研究 姓名：雨田 申请学位级别：硕士 专业：药物化学 指导教师：张梅 2007-04 摘要摘要 川明参 Chuanmingshen violaceum Sheh et Shan.为伞形科（Umbelliferae） 川明参属植物，是我国特有单种属植物，亦为四川道地药材，主要分布于川西平 原东部，以四川苍溪县最为集中。川明参以根入药，具有润肺化痰、和胃、生津、 解毒等功效， 主治肺热咳嗽、 热病伤阴， 为滋阴要药。 川明参常作为滋补品食用， 适用于病后补虚和强壮身体，为一药食同源植物。 本课题以川明参所含主要化学成分川明参多糖为研究

2、对象，首次系统研究 了其质量控制方法和药效学相关活性。 采用正交实验法确定川明参多糖的最佳提 取工艺和醇沉条件为：取川明参药材，加 8 倍量水提取两次，每次 90min；提取 液浓缩至 0.1 g.ml-1，加入乙醇至 80%。采用水相高效凝胶渗透色谱法测定川明 参多糖重均分子量为 976319，数均分子量为 52270；采用薄层色谱法和气相色谱 法分析证明多糖的单糖组成为甘露糖和葡萄糖，二者摩尔比为 1:16.2。采用浓氨 水喷雾法和小鼠气管段酚红法研究川明参多糖的祛痰镇咳药理作用，结果表明， 高剂量的川明参多糖溶液可显著增加小鼠气管酚红排泌量(PB（加水量），A 因素对多糖含量的影响有显著

3、性差异（P0.05 C 8.09976 2 0.04239 P0.05 D 191.07476 2 P0.05 根据方差分析结果，因素 A 为影响多糖含量的最重要因素，B、C 两因素和 空白列比较，对多糖含量的影响很小。因此 A 因素选择好水平，即 A2，B、C 两因素根据实际情况分别选择 B2和 C3。 成都中医药大学硕士学位论文 14 根据正交实验结果确定川明参多糖除蛋白条件为加入三氯乙酸至 5%，搅拌后离 心，离心转速 4000 转/min，离心时间 20min。 2.6 结果和讨论 用 Sevag 法精制后得到的多糖为疏松的白色粉末， 量较少， 该方法操作繁琐， 需反复多次， 费时较长

4、， 正丁醇和氯仿的消耗量大， 且在萃取过程多糖损失较大； 鞣酸法精制后得到的多糖，颜色为灰褐色，且较粘稠，不易干燥；用 TCA 方法精 制得到的多糖为白色疏松粉末。由上可知，用 TCA 方法除蛋白效果较好，无须重 复许多次，节省时间，所需试剂也大量节省。 根据正交实验结果确定川明参多糖除蛋白条件为加入三氯乙酸至5%，搅拌 后离心，离心转速4000转/min，离心时间20min。 成都中医药大学硕士学位论文 15 3. 含量测定 含量测定 多糖的含量测定一般采用分光光度法，显色方法主要有苯酚-硫酸法和蒽酮- 硫酸法，根据前期预实验结果结合相关文献资料，本课题选择苯酚-硫酸法测定 川明参药材中多糖

5、含量，并对显色条件包括苯酚用量、浓硫酸用量和水浴温度等 进行了考察。 3.1 仪器材料 川明参药材: 购于成都荷花池药材市场，产地为四川苍溪，由成都中医药大 学郭平博士鉴定为伞形科川明参属植物川明参 Chuanmingshen violaceum Sheh et Shen. D-无水葡萄糖（中国药品生物制品检定所，批号：110833-200302， 供含量 测定用） 8500 UV-VIS 分光光度仪（无锡科达仪器厂） BP121S 型 Sartorius 电子天平（北京 Sartorius 天平有限公司） 其他所用试剂均为分析纯 3.2 测定条件 3.2.1 最大吸收波长的选择 取无水葡萄糖

6、对照品适量，溶解于蒸馏水并稀释至一定浓度，经苯酚硫酸 法显色后，于 190600nm 范围内进行波长扫描，得到吸收曲线，在 490nm 处有 最大吸收。另取精制的川明参多糖样品适量，从“溶解于蒸馏水”起同法操作， 得到样品的吸收曲线，与对照品吸收曲线一致。因此选择 490nm 为测定波长。 成都中医药大学硕士学位论文 16 3.2.2 显色条件的考察 取川明参药材 50g，精密称定，按前期确定的工艺提取、醇沉、除蛋白后， 称取干燥至恒重的川明参多糖 25mg，精密称定，置于 50ml 容量瓶中，蒸馏水溶 解并稀释至刻度，取此多糖溶液 5.0ml 于 50ml 容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度。 按标

7、准曲线项下操作测定吸光度，对水浴温度、苯酚及浓硫酸用量等显色条件进 行考察。结果见表 3.1，3.2，3.3 和图 3.1，3.2，3.3。 表 3.1 水浴温度的考察（490nm） 水浴温度 （） 40 60 80 沸水 吸光度 0.2037 0.2144 0.5193 0.6780 水浴温度的考察 0 0.2 0.4 0.6 0.8 020406080100120 水浴温度 吸光度 图 3.1 水浴温度的考察（490nm） 结论：沸水浴时显色完全，确定水浴温度为沸水。 表 3.2 5%苯酚试剂用量的考察（490nm） 5%苯酚 （ml） 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 吸光度 0.

8、4360 0.6813 0.7474 0.2894 0.1834 成都中医药大学硕士学位论文 17 5%苯酚试剂用量的考察 0 0.2 0.4 0.6 0.8 00.511.522.53 5%苯酚试剂用量（ml） 吸光度 图 3.2 5%苯酚试剂用量的考察（490nm） 结论：5%苯酚试剂用 1.5ml 时显色完全，确定为 1.5ml。 表 3.3 浓 H2SO4用量的考察（490nm） 浓 H2SO4（ml） 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 吸光度 0.1393 0.3767 0.6091 0.7907 0.6859 硫酸用量的考察 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 02468

9、 硫酸用量（ml） 吸光度 图 3.3 浓 H2SO4用量的考察（490nm） 结论：浓 H2SO4用量为 6.0ml 时显色完全，确定为 6.0ml。 3.3 供试品溶液的制备 3.3.1 对照品溶液的制备 取 105干燥至恒重的无水葡萄糖 25mg，精密称定，置 25ml 容量瓶中，加水 成都中医药大学硕士学位论文 18 溶解后稀释至刻度制成葡萄糖储备液。分别精密吸取储备液 0.5，1.0，1.5，2.0， 2.5ml 置 50ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，制成不同浓度 1-5 号对照品溶液 备用。 3.3.2 样品溶液的制备 取精制的川明参多糖样品 25mg，精密称定，置 50ml

10、 容量瓶中，加蒸馏水溶 解后稀释至刻度作为储备液，精密吸取样品储备液 5.0ml 置 50 ml 容量瓶中，加 蒸馏水稀释至刻度备用。 3.4 线性关系的考察 3.4.1 标准曲线的绘制 精密吸取 15 号对照品溶液各 2ml 于 10ml 具塞试管中， 各加 1.5ml 5苯酚 试剂， 混匀， 精密加入 6ml 浓 H2SO4， 振摇后放置 5 min， 置沸水浴中加热 15 min， 立即转入冰水浴中冷却至室温，以蒸馏水为空白，在 490nm 波长处测定吸光度， 以吸光度 A 为纵坐标，葡萄糖溶液浓度 C 为横坐标，计算回归方程为：A = 10.749C+ 0.0131 r=0.998(n

11、=5)，表明无水葡萄糖在 0.020.1mg 范围内线性关 系良好。 见图 3.4。 成都中医药大学硕士学位论文 19 图 3.4 无水葡萄糖对照品的标准曲线 3.4.2换算因子的测定 精密吸取 3.3.2 项下多糖样品溶液 2.0ml，按 3.4.1 项下自“加 1.5ml 5苯 酚试剂”起同法操作，测定吸光度并计算多糖含量。 代入标准曲线计算：换算因子 FW/CD （W：多糖取样量；C：多糖溶 液中葡萄糖的浓度 D：稀释因素） F=1.18 （n=8） 3.5 精密度实验 精密吸取葡萄糖对照品溶液，按照 3.4 项下自“各 2ml 于 10ml 具塞试管中” 起同法操作，在较短时间内测定吸

12、光度，计算 RSD 值。见表 3.5。 表 3.5 精密度实验 测定次数 1 2 3 4 6 RSD(%) 吸光度 0.52630.5385 0.5456 0.5507 0.5349 1.8 结论：精密度符合要求。 成都中医药大学硕士学位论文 20 3.6 重现性实验 取川明参药材适量，平行五份，按最佳工艺提取后，取提取液测定吸光度， 计算 RSD 值。见表 3.6。 表 3.6 重现性实验 测定次数 1 2 3 4 5 RSD(%) 吸光度 0.6257 0.6385 0.5956 0.6107 0.6042 2.8 结论：重现性符合要求。 3.7 稳定性实验 精密吸取葡萄糖对照品溶液，按照

13、 3.4 项下自“各 2ml 于 10ml 具塞试管中” 起同法操作，间隔 0.5 小时测定吸光度，考察在 2.5 小时内的稳定性，计算 RSD 值。见表 3.7。 表 3.7 稳定性实验 结论：显色后在 2.5 小时内稳定性良好。 3.8 加样回收率实验 取已知多糖含量的药材适量，平行三份，分别精密加入葡萄糖对照品溶液， （对照品加入量约为样品含糖量的 80%，100%，120%）按照最佳工艺提取后浓 缩至一定体积作为供试品溶液。取此溶液 2ml，各平行两份，按含量测定项下方 法测定吸光度，计算回收率。见表 3.4。 回收率（测得值样品中糖含量）葡萄糖加入量100% 时间 （h） 0.5 1

14、.0 1.5h 2.0 2.5 RSD(%) 吸光度 0.4585 0.4679 0.4726 0.4517 0.4503 2.1 成都中医药大学硕士学位论文 21 表 3.4 加样回收率实验 样品号 样品中糖 含量 （mg） 加入葡萄糖量 （mg） 测得值(mg)回收率 (%) 平均回 收率(%) RSD(%) 1 0.0378 97.65 2 0.0170 0.0389 104.12 3 0.0412 105.00 102.20 2.90 4 0.0200 0.0407 102.50 5 0.0432 104.35 6 0.0212 0.0202 0.0192 0.0230 0.0421

15、99.57 结论：加样回收率符合要求。 3.9 样品测定 取各批川明参药材适量，按最佳工艺提取、浓缩，作为样品溶液。取此溶液 2ml，按标准曲线项下操作，测定吸光度，计算含量： 多糖含量%=CDF100/W （ C：样品溶液中葡萄糖的浓度；W：样品取样 量；D：稀释因素 F：换算因子）结果见表 3.8，3.9，3.10。 表 3.8 未加工川明参药材中多糖含量测定（产地：苍溪） 未加工药 材 C 样品 （mg.ml-1） A 平均 C测定 （mg.ml-1） 含量 （%） 1 2 3 4 0.2500 0.4551 0.0394 18.60 成都中医药大学硕士学位论文 22 表 3.9 加工后

16、川明参药材中多糖含量测定（产地：苍溪） 表 3.10 金堂产川明参药材中多糖含量测定 3.10 结果和讨论 由含量测定结果可知，未经加工的药材，多糖含量为 18.60%，经加工后的 药材多糖含量为 16.32%，含量有所下降。说明药材的产地深加工过程对多糖的 含量有一定影响，结合其加工过程，考虑应该是沸水掸煮时造成多糖的损失。 比色法使用历史悠久，20世纪4050年代先后报道了咔唑-硫酸法、蒽酮-硫 酸法和苯酚-硫酸法测定多糖含量。目前比色法已广泛应用于多糖含量测定，特 别是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法应用最广。 其原理是根据多糖在硫酸的作用下水 解成单糖分子，并迅速脱水生成糖醛衍生物，再将其与苯酚或葸酮缩合成有色化 加工后药 材 C 样品 （mg.ml-1） A 平均C 测定 （mg.ml-1） 含量 （%） 1 2 3 4 0.2538 0.3904 0.0351 16.32 金堂 C 样品 （mg.ml-1） A 平均C 测定 （mg.ml-1） 含量 （%） 1 2 3 0.5022 0.5233 0.0475 11.16 成都中医