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1、生物化学实验实验一、双缩脲法测蛋白质含量一、 实验目的：学习双缩脲测定蛋白质的原理和方法。二、 实验原理：具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用来测定蛋白质的浓度。三、试剂和器材1、测试样品(1)标准蛋白溶液：10mgml牛血清清蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液(用0.0 5 molL氢氧化钠溶液配制)。作为标准用的蛋白质要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度称量、配制成标准溶液。(2)测试样品液：人(鸭)血清(稀释l0倍)。测试其他蛋白样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。2
2、、试剂双缩脲试剂：将0.175g硫酸铜(CuSO45H2O)溶于约15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶中，加入30ml浓氨水，30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和NaOH溶液，摇匀，室温放置12h，再用蒸馏水定容至100ml后，摇匀备用。3、器材：试管，试管架，恒温水浴，722型分光光度计。四、操作方法1、标准曲线的绘制：取l 2支干试管分成两组，按下表平行操作。012345标准蛋白质/ml0.20.40.60.81.0蛋白浓度mg/ml2.04.06.08.010.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.20.0双缩脲试剂/ml4.04.04.04.04.04.0 充分摇匀后，室温下(20-
3、25) 放置30分钟吸光度(540nm)取两组测定的A540平均值，以A450为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。2、样品的测定：取4支试管分成两组，按下表平行操作。01血清稀释液ml0.5蒸馏水/ml1.00.5双缩脲试剂/ml1.04.0充分摇匀后，室温下(20-25) 放置30分钟A450五、计算：取两组平均值计算。血清样品蛋白质含量(g/100ml血清)(Y*N) / V 103 100固体样品蛋白质含量(%)= (Y*N) / C 100其中：Y为标准曲线查得蛋白质浓度(mg/ml)，N为稀释倍数，V为血清样品所取的体积(ml)，c为样品原浓度(mg/ml)。六、思考题1、试
4、述分光光度法的基本原理。2、总结实验过程的要点，你认为要注意哪些问题？3、比较不同样品的蛋白质含量。实验二 总氮量的测定凯氏(MicroKjeldahl)定氮法一、目的学习凯氏定氮法的原理和操作技术。二、原理常用凯氏定氮法测定天然有机物(如蛋白质、核酸及氨基酸等)的含氮量。含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢2元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程可表示如下：CH，NH，C00H+3H2S042C02
5、+3S02+4H20+NH。2NH3+H2S04一(NH4)2SO浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液巾原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。三、器材150 mL消化管或100 2凯氏定氮蒸馏装置或改mL凯氏烧瓶 进型凯氏定氮仪350 mL容量瓶 43 mL微量滴定管5分析天甲 6烘箱7电炉 81 000 mL蒸馏烧瓶9小玻璃珠 10远红外消煮炉四、试剂1消化液(过氧化氢：浓硫酸：水=3：2：1) 200
6、mL2粉末硫酸钾一硫酸铜混合物 16g,K2SO4与CuS04.5H20以3：1配比研磨混合。330氢氧化钠溶液 1000mL42硼酸溶液 500mL5标准盐酸溶液(约001 molL) 600mL6混合指示剂(田氏指示剂) 50mL由50mL 0.1甲烯蓝乙醇溶液与200mL 01甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。7市售标准面粉和富强粉各2g五、操作方法1凯氏定氮仪的构造和安装 凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应管及冷凝器3部分组成。蒸汽发生器包括电炉及一个1-2L（升）容积的烧瓶。蒸汽发生器借橡皮管与反应管相连，反应管上端有一个
7、玻璃杯，其上端通过反应室外层与蒸汽发生器相连，下端靠近反应室的底部。反应室外层下端有一开口，上有一皮管夹，由此可放出冷凝水及反应废液。反应产生的氨可通过反应室上端细管及冷凝器通到吸收瓶中，反应管及冷凝器之间借磨口连接起来，防止漏气。安装仪器时，先将冷凝器垂直地固定在铁支台上，冷凝器下端不要距离实验台太近，以免放不下吸收瓶。然后将反应管通过磨口连接与冷凝器相连，根据仪器本身的角度将反应管固定在另一铁支台上。这一点务须注意，否则容易引起氨的散失及反应室上端弯管折断。然后将蒸汽发生器放在电炉上，并用橡皮管把蒸汽发生器与反应管连接起来。安装完毕后，不得轻易移动，以免仪器损坏。2样品处理某一固体样品中的
8、含氮量是用lOOg该物质(于重)中所含氮的g数来表示()。因此在定氮前，应先将固体样品中的水分除掉。一般样品烘干的温度都采用105，因为非游离的水都不能在100以下烘干。在称量瓶中称入一定量磨细的样品，然后置于105的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。精确称取O 1 g左右的干燥面粉作为本实验的样品。3消化 取4个100mL凯氏烧瓶或50mL消化管并标号。各加1颗玻璃珠，在l及2号瓶中各加样品0.1.g，催化剂(K2S04一C
9、uS045HO)200 mg，消化液5 mL。注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3及4号瓶中各加0.1 mL蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放一漏斗，在通风橱内的电炉上消化。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出,S02白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。消化完毕，等烧瓶中溶物冷却后，加蒸馏水10 mL(注意慢加，随加随摇)。冷却后将瓶中溶物倾入50 mL的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并人量瓶。用水稀释到刻度，混匀备用。4蒸馏(1)蒸
10、馏器的洗涤 蒸汽发生器中盛有用几滴硫酸酸化的蒸馏水。关闭皮管夹，将蒸汽发生器中的水烧开，让蒸汽通过整个仪器。约15分钟后，在冷凝器下端放一个盛有5mL2硼酸溶液和12滴指示剂混合液的锥形瓶。位置倾斜如图所示，冷凝器下端应完全浸没在液体中，继续蒸汽洗涤12分钟，观察锥形瓶内的溶液是否变色，如不变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。向下移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1 cm，继续通蒸汽1分钟。用水冲洗冷凝管口后用手捏紧橡皮管。此时由于反应室外层蒸汽冷缩，压力减低，反应室内凝结的水可自动吸出进入反应室外层。最后打开皮管夹，将废水排出。(2)蒸馏取50mL锥形瓶数个，各加5mL硼酸和12滴指示剂，溶
11、液呈紫色，用表面皿覆盖备用。用吸管取10 mL消化液，细心地由蒸馏器小玻杯注入反应室，塞紧棒状玻塞。将一个含有硼酸和指示剂的锥形瓶放在冷凝器下，使冷凝器F端浸没在液体内。用量筒取30的氢氧化钠溶液10 mL放人小玻璃杯，轻提棒状玻璃塞使之流人反应室(为了防止冷凝管倒吸，液体流入反应室必须缓慢)。尚未完全流入时，将玻璃塞盖紧，向玻璃杯中加入蒸馏水约5 mL。再轻提玻璃塞，使一半蒸馏水慢慢流人反应室，一半留在玻璃杯中作水封。加热水蒸汽发生器，沸腾后夹紧皮管夹，开始蒸馏。此时锥形瓶中的酸溶液由紫色变成绿色。自变色时起记时，蒸馏35分钟。移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管约1 cm，并用少量蒸馏水洗涤冷
12、凝管口外面。继续蒸馏1分钟，移开锥形瓶，用表面皿覆盖锥形瓶。蒸馏完毕后，须将反应室洗涤干净。在小玻璃杯中倒人蒸馏水，待蒸汽很足、反应室外层温度很高时，一手轻提棒状玻璃塞使冷水流人反应室，同时立即用另一只手捏紧橡皮管。则反应室外层内蒸汽冷缩，可将反应室中残液自动吸出，再用蒸馏水自玻璃杯倒入反应室，重复上述操作。如此冲洗儿次后，将皮管夹打开，将反应室外层中废液排出。再继续下一个蒸馏操作。待样品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时进行滴定。(3)滴定 全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。(4)计算 C(V1 V2) 0.014100 消化液总量（m
13、l）总氮量= -% W 测定时消化液用量（ml）c为标准盐酸溶液摩尔浓度；V1滴定样品用去的盐酸溶液平均mL数；V2滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mL数；w为样品重量(g)。14为氮的相对量子质量。若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则，样品中蛋白质含量()=总氮量6.25若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。蛋白氮：总氮一非蛋白氮蛋白质含量(g)=蛋白氮6 25思考题1、 何为消化？如何判断消化终点？2、 在实验中加入H2SO4 、 K2S
14、O4 、CuSO4各有什么作用？3、 蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？4、 如何证明蒸馏器洗涤干净？5、 固体样品为什么要烘干？实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳一、目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。二、原理醋酸纤维薄膜电泳足用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120 t-m，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白，糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳中。三、器材1醋酸纤维薄膜(28 cm) 2常压电泳仪3点样器(市售或自制) 4培养皿(染色及漂洗用)5粗滤纸
