《精品课件《细胞工程》3第二章-基本技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《精品课件《细胞工程》3第二章-基本技术（64页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,第二章 细胞工程实验室及实验基本操作,第一节 实验室及仪器设备 第二节 实验基本操作 第三节 培养基及其配制,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,第一节 实验室及仪器设备,一、实验室设计 二、所需仪器设备,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,一、实验室设计,细胞工程是基于无菌条件下的研究和操作，需要建立一套满足无菌操作和无菌培养的环境。有机体的组织、器官或细胞可以通过无菌操作 过程获得无菌培养物，并在适宜的环境条件下 生长、发育和繁殖。,2010-20
2、11学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,一、实验室设计,基本操作室,无菌操作室,温室,培养室,细胞学实验室,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,一、实验室设计,此外，显微镜摄影、照片冲洗、显影，均需有一定的条件和设备。但可以根据实验的规模、种类以及工作人员的数目来设计实验室的大小和数目。最主要的目的是便于工作，有利于无菌条件。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,组培实验室设计原则,便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于观察,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,1. 基本操
3、作室,洗涤室（区） 灭菌室（区） 储藏室（区） 培养基配制室（区）,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,2. 无菌操作室,缓冲准备区(风幕) 接种区,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,3. 培养室,主要用于外植体的人工培养、储存及所需仪器设备的放置。为保证培养对象生长、繁殖所需的温度、湿度、光照、培养架、摇床、空调等。根据实验要求，室内不仅有照明设备，还需有暗室设备，以便进行暗培养。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,4. 细胞学实验室,又称为鉴定分析室，主要用于实验材料的研究和观察
4、分析，应宽敞明亮。所需的仪器设备有各种显微镜及照相系统、解剖镜等。本实验室可根据实际需要而定。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,5. 温室,植物组织培养的最终产物为试管苗，需对其进行炼苗和移栽，培养正常的生产植株。温室为试管苗提供满足生长的适宜的环境条件。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,二、所需仪器设备,必要器皿 常用仪器,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,必要器皿,培养器皿 提供接种物生长的器皿。 盛装器皿 药品溶解或各种培养基母液储备。 计量器皿 量筒、移液管、微量进样器
5、。 金属器械 用于解剖、取材、剪切组织,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,常用仪器设备,1. 基本设备： 冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培 养基分装器、搅拌器。 2. 灭菌设备： 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。 3. 无菌操作设备： 净化工作台、接种箱。 4. 光温控制设备： 时间程序控制器、空调及温度感应器。 5. 细胞培养设备： 培养设备据需要而定，如培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。 6. 细胞学鉴定设备： 光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师:
6、董玉梅,第二节 实验基本操作,一、清洗 二、消毒灭菌 三、无菌操作,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,一、清洗,植物组织与细胞培养工作要顺利进行，首要的关键是必须保证无菌，以避免污染。除培养材料和用具进行严格的消毒外，各种培养用具在消毒以前均需洗涤清洁，以防止带入一些有毒的化学物质，不利于细胞生长。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,一、清洗,清洗的对象及方法,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,清洗的对象,玻璃器皿 塑料器皿 金属器械 除菌过滤器,2010-2011学年上学期,课程
7、名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,玻璃器皿,新购置的玻璃器皿，常有游离碱性物质，使用前，先用1稀盐酸浸泡过夜，然后用洗衣粉洗涤，清水冲洗，晾干备用。 已用过的玻璃器皿用洗衣粉刷洗，清水冲洗，晾干备用。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,塑料器皿,新的塑料器皿打开即用 用过的塑料器皿先用2%NaOH浸泡过夜，然后用清水冲洗，再用2% 5% 稀盐酸浸泡30min，清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗一遍，晾干备用。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,金属器皿,新的金属器皿用热洗衣粉水洗净，冲洗后擦干即可。 另，培养器皿已污染时，
8、用蒸汽高压灭菌后清洗。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,二、消毒灭菌,1. 消毒灭菌的方法 2. 消毒灭菌的对象,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,二、消毒灭菌,培养植物组织和细胞的培养基，含有植物细胞所需的营养物质，同时对于细菌等微生物也是很好的营养物质。微生物比植物细胞生长更为迅速，并且产生毒素，以致培养的细胞死亡，因此防止污染是植物组织培养技术中的重要环节。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,发生污染的来源有：,（1）器皿与用具 （2）培养基 （3）培养的材料 （4）操作时
9、的空气 （5）工作人员操作带菌,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,消毒方法一般有物理方法和化学方法两种，即用物理和化学方法杀灭微生物。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,物理方法,干热灭菌法 湿热灭菌法 过滤除菌法 射线消毒灭菌法 酒精灯消毒灭菌法,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,化学法：,消毒剂灭菌法 （乙醇、过氧乙酸、甲醛、升汞等） 抗生素抑菌法 （青霉素、链霉素、新霉素、潮霉素等）,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,1、培养基用湿热灭菌
10、,培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,1、培养基用湿热灭菌,注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气
11、阀。 关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1-0.15MPa，20分钟。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,高压蒸汽灭菌所必需的最少时间,按容器大小不同，保压时间有所不同，见表。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。 容器的体积/mL 在121灭菌所需最少时间/min 20-50 15 75-150 20 250-500 25 1000 30,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,灭菌结束,到达保压时间后，即可切断电源，在压力到0.5MPa，
12、可缓慢放出蒸汽，应注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,灭菌结束,当压力降到零后，才能开盖，取出培养基，摆在平台上，以待冷凝。不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养基无法摆斜面。一旦放置过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气压入，内外压力平衡，盖子便易打开了。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,注意事项,对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种工具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又
13、要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。 对于一些布制品，如实验衣、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30分钟。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,2、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌,在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500毫升的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,3、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌,干热灭菌是利用烘箱加热到160-180的
14、温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用170持续90分钟来灭菌。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免防碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,4、不耐热的物质采用过滤灭菌,经高温
15、灭菌后赤霉素GA3的活性仅及不经高温灭菌的新鲜溶液的10%。蔗糖经高温后部分被降解成D-葡萄糖和D-果糖，果糖又可被部分水解，产生抑制培养的植物组织生长的物质。 NAA，2，4-D和激动素等在高温下是比较稳定的。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,4、不耐热的物质采用过滤除菌,以上所述物质的化学成分在高温高压下会发生降解而失去效能或降低效能。又如赤霉素、玉米素、脱落酸是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,防细菌滤膜的网孔的直径为0.220.45微米，当溶液通过滤膜后，
16、细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，从而达到除菌的目的。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,过滤除菌操作步骤：,首先将过滤器、接液瓶用纸包好，滤膜可放在培养皿内用纸包好。使用前先经121高压蒸汽灭菌30分钟；在超净工作台上，将滤器装置装好，用灭菌无齿镊子将滤膜安放在隔板上，滤膜粗糙面向上；然后将待除菌的液体注入滤器内，开动真空泵即可过滤除菌。滤液经培养证明无菌生长后可保存备用。,2010-2011学年上学期,课程名称: 细胞工程 任课教师: 董玉梅,在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。,201
