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1、 生物农药课程设计 生物农药绿僵菌油剂 的研发及推广 学号:200701160718 姓 名：田钟波 授课老师：尹晓辉 班 级：植保 071 生物农药绿僵菌油剂的研发和推广 一、 研究背景 ：绿僵菌是一类重要的生防真菌, 可寄生多种昆虫 ,在生产中已得到广泛的应用,据不完全统计,全世界约有 200 多种昆虫能被这种真菌感染致死。该菌致病力强、效果好 ,对人、畜和农作物无毒害,是当前世界上研究应用最多的虫生真菌之一。全球对绿僵菌的研究已有 100 多年的历史,但由于受到许多因素的制约,导致其效果不稳定,极大地制约了其规模化生产和应用。直到 1988 年,用于澳洲甘蔗和牧草害虫防治制剂的出现,其应
2、用才算取得较大进展。此后几年 ,国内外均研制出了各自的绿僵菌制剂用于草原蝗虫和地下害虫的防治 ,取得了显著的成效。并且，绿僵菌能在自然界中存活，到第二年还能再次侵染害虫，降低重复施药的成本,持效性比其他农药好。 目前国内外研究的真菌生防制剂 100 多种，全世界已经注册的真菌杀虫剂有51 个，其中绿僵菌 17 个（表）。 序号 商品名 目标害虫 生产商或国家 序号 商品名 目 标害虫 生产商或国家 1 Back-off-1 介壳虫 白粉虱 美国 10 metarhizin 白 粉虱 巴西 2 Bio1020 蛴螬 美国 Bayer 11 Merobinl 甘 蔗沫蝉 巴西 3 Bior bla
3、st 白蚁 美 国EenSience 12 Metquino 甘 蔗沫蝉 巴西 4 Biocontrol 甘蔗沫蝉 巴西 13 百澳可 Bioc 蜚蠊 中国 5 Biotrol FMA 蚊子 美国 Abbott 14 蝗虫 1 号 蝗虫 中国 6 BioGreenTM 甘蔗沫蝉 巴西 15 BioCane Granules 甘蔗金龟 澳大利亚 7 Biomax 甘蔗沫蝉 巴西 16 Green Muscle 蝗虫 英国 CABI 8 Bior PathTM 蜚蠊 美 国EenSience 17 Green Guard 蝗虫 澳大利亚 9 Combio 甘蔗沫蝉 巴西 （一）绿僵菌防治害虫的方式
4、： 虫生真菌酶入侵是机械压力和各种酶共同作用的结果。虫生真菌在入侵昆虫体壁前存在一个对营养的选择作用，并造成物理压力，因此能使真菌侵入内含各种丰富营养物质的虫体；另一方面，在入侵过程中，真菌分泌的酶可消解表皮，最终达到侵染虫体的目的。目前的研究表明，虫生真菌在入侵昆虫体壁过程中，分泌的酶有蛋白质酶、几丁质酶、脂酶和淀粉酶等。其中不少与入侵过程中表皮的降解、侵染机构的形成以及菌株的毒力等关系密。 绿僵菌可以多种肥蛋白质毒素和一些蛋白质毒素。毒素的作用,使初期聚集于菌丝体周围的吞噬细胞失去吞噬作用, 任由菌丝生长繁殖。毒素亦影响中枢神经系统,使神经传导受到障碍,失去正常的反射作用。侵入脂肪体内的菌
5、丝,大量吸收脂肪和细胞内的营养物质 ,而使细胞结构受到破坏,致使整个脂肪组织崩解。毒素能促使寄主组织逐渐衰变 ,但寄主细胞无明显的肿大和皱缩。毒素的主要影响似乎作用于各细胞器膜结构的完整性上 ,组织细胞因失液而严重脱水 ,这或许是引起寄主死亡的主要原因。 （二）绿僵菌侵染机理： 绿僵菌对寄主的入侵是寄主与病原菌之间的生理生化作用的综合结果，可通过体壁、气门、消化道等多种途径侵染宿主 ,其中体壁途径是主要方式。这种侵染方式体现了真菌的特点。其致病过程一般可以分为 9 个阶段: 分生孢子附着昆虫表皮; 感染性单位在表皮上萌发,这一过程需要较高的温度; 穿透表皮。分生孢子萌发形成的芽管直接穿透表皮或
6、形成附着胞牢固的附着在表皮上 ,然后从附着胞上产生细长的侵入丝深入表皮，这一过程是在芽管萌发生长时产生的机械压力和其在生长过程中分泌的相关酶的联合作用下共同完成。分泌的酶可降解体壁中的蛋白质和几丁质等物质 ,从而使孢子萌发的芽管得以穿透体壁 ;菌丝在体腔内生长; 产生毒素。许多虫生真菌在广泛侵入寄主之前就战胜了寄主的保卫反应, 认为是毒素起了重要作用 ,已知毒素多为小分子缩羧肽及蛋白酶类; 寄主死亡; 菌丝在寄主体内大量繁殖, 侵入寄主的所有器官, 最终使虫体僵硬; 菌丝从寄主体内穿出; 产生新的感染单位并发生扩散。 二、绿僵菌的研发 绿僵菌作为一种侵染广，对环境无害的生物源农药，具有很好的开
7、发前景。利用生物源农药防治有害生物能减少化学农药对环境的危害，同时也不存在出现抗性变异的现象。 现在就绿僵菌，从菌株筛选开始到投产，进行一次完整的设计。获得的绿僵菌菌株主要用于防治蝗虫，制剂为油剂。 （一） 、原始菌株的获得： 菌株主要是从自然界中的僵虫和土壤中获得。土壤获得的主要是 PDA 培养基和大蜡螟诱导两种方法分离土壤样本中的虫生真菌，僵虫可以直接放到培养皿中保湿培养获得。 该菌株主要是从土壤中获得，因为土壤中获得 的菌株数量较多。使用 PDA培养基和大蜡螟诱导两种方法分离土壤样本中的虫生真菌，共筛选土壤样本 320份。用 PDA 培养基分离虫生真菌时，其检出率为 13%，用大蜡螟诱导
8、法分离虫生真菌时，检出率可高达 70%，两者存在很明显的差异。 对分离到的虫生真菌菌株，选取 24 株产孢较好的菌株，进行虫生真菌的毒力测定，供试试虫为本实验室饲养的蝗虫和小菜蛾。毒力测定结果显示，绿僵菌189 对东亚飞蝗的致病性较高，白僵菌 07-10-4 对小菜蛾的致病性较高。绿僵菌189 在 1107孢子/mL 水平上对东亚飞蝗的校正死亡率达到 78.19%，白僵菌菌株07-10-4 在 1106孢子/mL 水平上对小菜蛾的校正死亡率达到 52.70%。通过对绿僵菌菌株 189 不同浓度对东亚飞蝗的致病性测定，使绿僵菌 189 对小菜蛾的最高校正死亡率达到 85.55%，而白僵菌 07-
9、10-4 对小菜蛾的最高校正死亡则达到84.44%。由于我们主要是研制防治蝗虫的菌株，因此选择 189 为初始菌株。 （二） 、菌株改造： 从自然界获得的原始菌株，一般对化学杀菌剂都不存在抗性。但是，杀菌剂在农业生产当中使用时不可避免的。因此对原始菌株进行基因改造，使其含有对杀菌剂的抗性。 首先将苯菌灵抗性基因 BenA3 插入植物表达载体 pCAMBIA1300 中，经酶切和 PCR 鉴定，确定载体 BEN-CAMBIA1300 构建成功，然后送往公司测序设计引物。采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态和农杆菌感受态，将质粒pBEN-CAMBIA1300 转入大肠杆菌 JM110 中，得到大量质粒；
10、再利用冻融法将植物表达载体 pBEN-CAMBIA1300 转入根癌农杆菌 AGL-1 中，从而制备一定量的工程菌。 利用农杆菌介导法转化。通过农杆菌 AGL-1 与绿僵菌 189 共培养，目的是将质粒载体 BEN-CAMBIA1300 的 T-DNA 随机插入绿僵菌 189 基因组中，在含有能抑制 189 生长的苯菌灵含量的平板上连续转接五代，挑取稳定生长的转化子单独培养。提取转化后的绿僵菌 189 菌株的基因组 DNA，经过 PCR 检测，得到了 T-DNA 插入绿僵菌 189 菌株的阳性克隆。 这样就得到了改造后具有苯菌灵抗性的绿僵菌 189 菌株。 （三） 、对蝗虫进行生测： 主要是对
11、 189 改造菌株对蝗虫的效果进行测定。包括室内和室外两个部分。室内测定的方法：刮取新鲜菌落，加适量精制大豆油，研磨成高浓度的孢子油悬液，用血球计数板测定孢子含量，再用大豆油和柴油的混合油稀释成系列孢子含量的油剂。用枪头直接涂抹于 4 龄蝗蝻的腹部侧面，每虫 1L ，即每头试虫最低孢子剂量从 1.6 个/ 头开始计算。从第 3 天记录死亡虫数，到最高剂量处理的死亡率达到 100%为止。每个处理 30 头 4 龄蝗蝻，重复 3 次。 室外测定方法：矿物油为普通煤油,植物油为精炼菜籽油,按 11 混合后作为溶剂配制喷雾用油剂，配制孢子油剂。用喷雾器在田间喷洒，分别进行抽样调查罩笼调查 分别在喷药后
12、 1 小时和 48 小时从各小区随机网捕约 100 头蝗虫,装入方形纱网笼 (40cm 40cm 50cm)于露天环境下 (为防降雨设有顶棚 )饲养, 每天上午饲喂足量的新鲜无芒稗草。由于蝗虫样本从田间采集至笼内需 3 小时以上,初期死亡较多,而感染绿僵菌的蝗虫不会很快死亡,故观察记载从第 3 天开始。每天从死虫中抽取样本放入培养皿( 皿中垫有滤纸并保持其饱和湿度), 待菌丝长出时鉴定其是否为绿僵菌。蝗虫死亡情况记载直到笼中的蝗虫全部死亡为止。田间调查 采用目测前方 1m2 内蝗虫数量的方法估计种群。4 人从小区中心点开始分别沿对角线行进,每行进 1m 记载前方 1m2 内的蝗虫数,每人记录
13、25 个样点,每小区100 个。于喷药前、然后每隔 3 天,至喷药后第 18 天,记录蝗虫种群数量、死亡率,进行统计分析。 另外还要对其进行二次侵染能力观察。对僵虫进行保湿培养，待表皮长出绿僵菌孢子以后与笼内，每笼放入 30 头健康蝗虫，3 个重复。逐日观察蝗虫发病集死亡状况，持续观察 12 天。记录蝗虫种群数量、死亡率,进行统计分析。 三、规模化生产： （ 1） 、发酵： 绿僵菌的生产也就是发酵。国内外发酵绿僵菌的方法主要有液体深层发酵、固体发酵和液固双相发酵这三种。液固双相发酵是迄今所知国内外气生分生孢子最成熟的生产工艺，是最有可能在农业生产中大规模应用的。 液固双相发酵过程包括液体房角和
14、固体发酵两个阶段，具体是通过摇瓶或者发酵罐快速产生大量菌丝或芽生孢子，然后转接到固体培养基或惰性机制上产孢。工艺流程图如下： 斜面菌中 摇瓶培养 发酵罐 固体培养 预干燥 分离孢子 后干燥 包装 保存 培养基质：大规模发酵生产绿僵菌分生孢子主要以大米，麦麸和米糠为基质。 液相培养 : 一级种培养基为(g/L): 蔗糖 20g, 酵母浸粉10g,K2HPO45g,MgSO42g,FeSO4 7H2O 0 01g。于 27、 200r/min 摇床培养 60h。二级种培养基为(g/L): 食用蔗糖 20g,蛋白胨 5g,酵母粉 10g,玉米粉 20g。于 27、200r/min 摇床培养 72h。
15、 固相培养：蛭石和稻壳均可作为固相培养的优良载体,以蛭石为载体的产孢量稍高于稻壳。玉米粉和麦麸组合是该菌的良好营养源 ,可与不同载体配合均，如以小米提供营养,当小米与载体的质量比大于 31 可获得较多孢子。液固接种比以 810 最佳; 接种后适宜的基质含水量约为 55%;在培养过程中,恒温培养时以25为宜; 最佳温度调节方式是先在 25下培养 16d 后转移到 21下再培养 5d,可获得最高产孢量; 光照调节对菌株生长和产孢有重要影响 ,培养前期在暗环境培养 14d,再于光照培养 7d 的产孢量最高; 高通气量利于菌株生长和产孢,应保持容器通气口通畅,培养基厚度以4cm 为宜。 （ 2） 、干
16、燥 ： 目前主要有高真空冷冻干燥、高真空室温抽干、 35下烘干和低真空低热干燥条件下进行不同程序的干燥处理。为了保证绿僵菌孢子粉不失去活性，以低真空低热干燥法为最佳，低真空(0.1 MPa) 低热(30 ) 抽干 2024 h。干燥后的孢子粉含水量应在 5以下，但是不水分也不能太低。 （ 3） 、制剂： 由于防治的是蝗虫，蝗虫的活动性较强，并具有迁飞的习性。在目前所能制造的制剂类型当中，油剂喷洒比较适合用于防治蝗虫。 油剂的配方：50孢子粉，215载体，2增效剂，15紫外吸收剂，25的大豆色拉油。 喷洒量：60ml/亩（大部分现在使用油剂的用量） 在油剂制作完成以后，要进行室内跟室外的杀虫实验，已确定其效果以及在野外使用的剂量。具体的方法可以按照前面对改造后菌株测定器杀虫活性的方法。这里不再重复。 在实际的生产当中，可以添加少量的化学杀蝗虫剂于绿僵菌孢子粉进行复配。目
