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1、第五讲第五讲 ATP生物发光检测技术生物发光检测技术 自然界有很多发光生物体自然界有很多发光生物体 ?真菌、甲虫、蠕虫、海星，等等，还有我们 最熟悉的萤火虫 真菌、甲虫、蠕虫、海星，等等，还有我们 最熟悉的萤火虫 ?海洋中有好几千种发光生物。深夜，在海中 游泳或岸边漫步时，都会看到海上的 海洋中有好几千种发光生物。深夜，在海中 游泳或岸边漫步时，都会看到海上的“磷光磷光” 现象。这往往是大群甲藻现象。这往往是大群甲藻一种单细胞浮 游生物 一种单细胞浮 游生物受到机械干扰后留下的道道光痕受到机械干扰后留下的道道光痕 ?它们几乎对任一种刺激，如海水中化学成份 的波动、压力突变、超声波和激光刺激等
2、等，都会有闪光反应 它们几乎对任一种刺激，如海水中化学成份 的波动、压力突变、超声波和激光刺激等 等，都会有闪光反应, 大多海洋生物都靠荧光 素 大多海洋生物都靠荧光 素荧光素酶系统发光荧光素酶系统发光 . ?不同的荧光素不同的荧光素荧光素酶反应产生不同的 光 荧光素酶反应产生不同的 光 发光生物发光生物 ? 有许多微小甲壳动物和腔肠动物，在有许多微小甲壳动物和腔肠动物，在 被惊动时会发出闪光。有一些动物虽被惊动时会发出闪光。有一些动物虽 然自己不闪光，但把荧光素和荧光素然自己不闪光，但把荧光素和荧光素 酶分泌入水中，让它们相互作用，产酶分泌入水中，让它们相互作用，产 生光雾，掩护自己逃走。生
3、光雾，掩护自己逃走。 ? 但后来在好多鱼类、鱿鱼类和甲壳类 中，也都找到了这种腔肠动物型的荧 光素。 但后来在好多鱼类、鱿鱼类和甲壳类 中，也都找到了这种腔肠动物型的荧 光素。 ? 多年前，科学家已经将生物萤光应用 到生命科学领域。与化学荧光 （ 多年前，科学家已经将生物萤光应用 到生命科学领域。与化学荧光 （fluorescence）相比，生物萤光 （ ）相比，生物萤光 （bioluminescence）更灵敏、更 可信、效果更好。 ）更灵敏、更 可信、效果更好。 一 ATP生物发光法检测原理一 ATP生物发光法检测原理 ? ATP生物发光技术的原理是荧光素酶（生物发光技术的原理是荧光素酶（
4、Lu ciferase）以荧光素（）以荧光素（Luciferin）、 三磷酸腺苷（ ）、 三磷酸腺苷（ATP）和）和O2为底物，在为底物，在Mg2 存在时，能将化学能转化为光能。存在时，能将化学能转化为光能。 ? ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又 是所有生物生命活动的能量来源。在荧光素 酶催化的发光反应中， 既是荧光素酶催化发光的必需底物，又 是所有生物生命活动的能量来源。在荧光素 酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范 围内，其浓度与发光强度呈线性关系。 在一定的浓度范 围内，其浓度与发光强度呈线性关系。 检测原理检测原理 ? 各生长期的微生物均有较恒定水平的各生长期的微生物均有较
5、恒定水平的ATP含 量，微生物死亡后， 含 量，微生物死亡后，ATP将很快被分解掉将很快被分解掉, ? 因此，提取细菌的因此，提取细菌的ATP，利用生物发光法测 出 ，利用生物发光法测 出ATP含量后，即可推算出样品中的含菌 量，整个过程仅为几分钟。 含量后，即可推算出样品中的含菌 量，整个过程仅为几分钟。 ? 优点优点: 由于生物发光法无需培养微生物过 程，操作简便、灵敏度高，在短时间内即可 得到检测结果，具有其他微生物检测方法无 可比拟的优势， 由于生物发光法无需培养微生物过 程，操作简便、灵敏度高，在短时间内即可 得到检测结果，具有其他微生物检测方法无 可比拟的优势，是目前检测微生物最快
6、的方是目前检测微生物最快的方 法之一。法之一。 ?AT P 生 物发光法是利用生 物发光法是利用ATP与虫荧光素一虫荧光素酶反应， 产生光子，再用荧光照度计检测发光值，从而得到 与虫荧光素一虫荧光素酶反应， 产生光子，再用荧光照度计检测发光值，从而得到ATP的量的量. 海肾荧光素酶海肾荧光素酶海肾荧光素酶海肾荧光素酶(Renilla luciferase)催化的发光反应， 具有很好的浓度线性范围，酶的检测灵敏度达到 催化的发光反应， 具有很好的浓度线性范围，酶的检测灵敏度达到10-18 mol。 二、ATP生物发光法检测过程二、ATP生物发光法检测过程 ATP生物发光法检测微生物，需要先将微
7、生物体内的 生物发光法检测微生物，需要先将微 生物体内的ATP提取出来，测量其发光值， 对照由标准 提取出来，测量其发光值， 对照由标准ATP试剂测量所得发光值和试剂测量所得发光值和 ATP的浓度标准曲线，根据发光值得到的浓度标准曲线，根据发光值得到ATP 的浓度，最后转化为微生物的浓度。的浓度，最后转化为微生物的浓度。 1、试剂与仪器1、试剂与仪器 主要试剂：主要试剂： ? 荧光素荧光素/荧光素酶试剂荧光素酶试剂 ? 标准标准ATP试剂试剂 ? 缓冲液缓冲液 ? ATP提取剂提取剂 主要仪器：主要仪器： ? TD-20/20荧光光度计荧光光度计 ? 抽滤器及真空泵抽滤器及真空泵 ? pH计计
8、 2、ATP的提取2、ATP的提取 1)在测量微生物的在测量微生物的ATP前，需要将前，需要将ATP从微生 物内提取出来， 从微生 物内提取出来，ATP的提取效率直接影响生 物量测定结果。因此， 的提取效率直接影响生 物量测定结果。因此，ATP的提取也就成为的提取也就成为 ATP生物发光法测定生物量的重要步骤之一。生物发光法测定生物量的重要步骤之一。 2)提取方法提取方法:TCA(三氯醋酸三氯醋酸)法和加热煮沸法提 取 法和加热煮沸法提 取ATP。 3、 ATP的检测3、 ATP的检测 1)先用先用标准标准ATP试剂作一条标准曲线。测量得到样品 的 试剂作一条标准曲线。测量得到样品 的相对发光
9、值相对发光值. 2)测定样品发光值测定样品发光值,与标准曲线对比，得到样品中的与标准曲线对比，得到样品中的 ATP含量含量, ATP含量可以转化为微生物的浓度含量可以转化为微生物的浓度. 3)测量荧光所用的仪器测量荧光所用的仪器: TD-20/20荧光光度计荧光光度计 。 相对光单位 三、ATP生物发光法的食品应用研究三、ATP生物发光法的食品应用研究 1 食品微生物检测:食品微生物检测:与传统微生物检测方法相比，与传统微生物检测方法相比，ATP生 物发光法具有简便、灵敏、快速等优点，小型化的测试仪器便 于随身携带，非常适合现场卫生监测。在现场使用，可迅速发 现可能存在的污染环节，及时采取措施
10、，从而尽可能避免产品 和资金的浪费。 生 物发光法具有简便、灵敏、快速等优点，小型化的测试仪器便 于随身携带，非常适合现场卫生监测。在现场使用，可迅速发 现可能存在的污染环节，及时采取措施，从而尽可能避免产品 和资金的浪费。 2 可以用于食品、饮品及空气卫生检测中细菌总数的现场测定。 用于卫生监督 可以用于食品、饮品及空气卫生检测中细菌总数的现场测定。 用于卫生监督,口岸监察及企业自检。口岸监察及企业自检。 所得试验结果所得试验结果90%以上与标准培养 法所得结果一致。精确度和重复性也 和培养法测定菌落总数相差无几 以上与标准培养 法所得结果一致。精确度和重复性也 和培养法测定菌落总数相差无几
11、 食品细菌快速测定仪食品细菌快速测定仪 量程范围量程范围 0-107cfu/ml 检出时间检出时间 : 小于小于5分钟，分钟， 萤光素酶做报告基因萤光素酶做报告基因 ? 报告基因是研究报告基因是研究基因调控基因调控的有力工具，利用萤光素 酶做报告基因的基本的研究方法，是将一段待研究 的 的有力工具，利用萤光素 酶做报告基因的基本的研究方法，是将一段待研究 的DNA序列这段序列序列这段序列可以是可以是启动子、增强子启动子、增强子 或具有潜在调节功能的一段或具有潜在调节功能的一段DNA序列序列克隆在 一个含有 克隆在 一个含有萤光素酶基因的载体萤光素酶基因的载体上上 ? 再将这个载体转染真核细胞，
12、经过一段时间的培养 和不同的 再将这个载体转染真核细胞，经过一段时间的培养 和不同的外界刺激后外界刺激后，收获细胞并将细胞裂解，然 后测量细胞裂解物的萤光强度。 ，收获细胞并将细胞裂解，然 后测量细胞裂解物的萤光强度。 ? 通过与对照组（通过与对照组（未经外界刺激未经外界刺激的）细胞裂解物萤光 强度的比较，确定这一段 的）细胞裂解物萤光 强度的比较，确定这一段DNA序列的调节功能 （即：启动子功能，增强子功能， 等等）。 序列的调节功能 （即：启动子功能，增强子功能， 等等）。 ? 萤火虫萤光素酶作为报告基因萤火虫萤光素酶作为报告基因:因为该蛋白不需要 翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性 因为该蛋白不需要 翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性 海肾荧光素酶海肾荧光素酶
