现代色谱分析讲稿1

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1、现代色谱分析现代色谱分析 色谱法原理色谱法原理 气相色谱法气相色谱法 高效液相色谱法高效液相色谱法 第一章色谱法原理第一章色谱法原理 Principles of ChromatographyPrinciples of Chromatography 1-1 概述 色谱法早在1903年由俄国植物学家Tsweet分离植物 色素时采用。后来不仅用于分离有色物质，还用于分 离无色物质，并出现了种类繁多的各种色谱法。许多 气体、液体和固体样品都能找到合适的色谱法进行分 离和分析。目前色谱法已广泛应用于许多领域，成为 十分重要的分离分析手段。 色谱法的种类很多，但不管属于哪一类色谱法，其共同的基本特 点是具

2、备两个相：不动的一相，称为固定相；另一相是携带样品流 过固定相的流动体，称为流动相 不动的一相，称为固定相；另一相是携带样品流 过固定相的流动体，称为流动相。当流动相中样品混合物经过固定 相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差 异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力 的作用下，不同组分在固定相滞留滞留时间长短不同，从而按先后不同 的次序从固定相中流出。 色谱法分类色谱法分类 1按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC），根据固定相是固体 吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液 体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）

3、液体为流 动相的色谱称液相色谱（LC）。同理，液相色谱亦可分为液固色谱 （LSC）和液液色谱（LLC）超临界流体为流动相的色谱称为超 临界流体色谱（SFC）。 2 2按分离机理分类按分离机理分类 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分 离的方法，称为吸附色谱法吸附色谱法(adsorption chromatography)。利用组分 在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱 法 分配色谱 法(partition chromatography 。利用组分在离子交换剂（固定相）上 的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法离子交换色谱法(ion exch

4、ange chromatography )。利用大小不同的分子在多孔固定相中 的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法 尺寸排阻色谱法 (steric exclusion chromatography )。以上四种为基本类型色谱法。 此外还有： 亲和色谱法(affinity chromatography)：专属亲和力 手性色谱法(chiral chromatograohy)：手性固定相 毛细管电泳法(capillary electrophoresis)：电泳淌度 3 3按固定相的外形分类按固定相的外形分类 固定相装于柱内的色谱法，称为固定相装于柱内的色谱法，称为柱色

5、谱柱色谱柱色谱柱色谱，它又可分，它又可分 为为填充柱色谱填充柱色谱和和毛细管色谱毛细管色谱；固定相呈平板状的色谱；固定相呈平板状的色谱 法，称为法，称为平板色谱平板色谱平板色谱平板色谱，它又可分为，它又可分为薄层色谱薄层色谱和和纸色谱纸色谱。 1-2 1-2 色谱法实验结果评价色谱法实验结果评价色谱法实验结果评价色谱法实验结果评价 1. 系统适用性试验 主要是对色谱仪与实验条件构成的色谱系统的检验，包括： 理论塔板数 分离度：无特殊规定时，定量峰与相邻峰的Rs1.5 重复性：峰面积的RSD2.0(n=5) 拖尾因子：T：0.951.05 2. 建立色谱分析方法需要考察的内容： 精密度(prec

6、ision)： 日内精密度：重复性repeatability (intra-day) 在相同实验条件下，由 一个分析人员测定所得结果的精密度。 日间精密度： time-different intermediate precision (inter-day) 中间精密度：同一实验室，不同分析人员、不同设备测定结果的精密 度。考察随机变动因素对精密度的影响。 重现性(reproducibility )（再现性，室间精密度）：在不同实验室，由不 同分析人员测定结果的精密度。 准确度(accuracy) 回收率试验：常用此方法来评价方法的准确度。 灵敏度、检测限和定量限： 仪器检测限：相对于背景仪器检

7、测的最小的可靠信号（S/N 3） 方法检测限：某方法可检测的最小浓度，通常把浓度为零时的标准偏差 定义为方法检测限。 在低浓度范围侧3个浓度，每个浓度测多次计算其标准偏差，以标准 偏差对浓度做回归线，把回归线延长外推至纵轴的交点的标准偏差即为 方法检测限。 样品检测限：相对于空白可检测的最小样品含量。 A c D 3 ：空白10次以上测定是标准偏差；c为浓度接近检出限的样品液的实 际浓度；A为测得的样品液的信号值。 定量限：是指样品中被测物质能被定量测定的最低量。通常K10 定量范围和线性 定量范围：即一个定量分析方法的适用范围，指分析物浓度的上、下限 范围。 线性：指在规定的范围内，实验结果

8、和分析浓度呈线性的能力。通常用 线性相关系数，统计意义上用工作曲线斜率的方差。 1-3 1-3 色谱流出曲线及有关术语色谱流出曲线及有关术语色谱流出曲线及有关术语 色谱流出曲线及有关术语 一流出曲线和色谱峰一流出曲线和色谱峰 图图1-1 如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围 内，色谱峰如果对称，可用内，色谱峰如果对称，可用GaussGauss正态分布函数表示：正态分布函数表示： )( 2 1 exp 2 2 0 r ttC C 式中：C不同时间t时某物质的浓度，C0 进样浓度，tr 保留时间， 标准偏差。 二、基线 是柱中仅有流动相通

9、过时，检测器响应讯号的记录值，即 图1-1中Ot线稳定的基线应该是一条水平直线 三、峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图1-1中 BA 拖尾峰（tailing peak） ：前沿陡峭，后沿拖尾的不对称色谱峰。 前延峰（leading peak）：前沿平缓，后沿陡峭的不对称色谱峰。 对称因子（fs ）或拖尾因子（T）:衡量对称峰与不对称峰的参数. A AB fs 2 fs =0.951.05为正常峰 fs 1.05为拖尾峰 图1-2.图1-2.不对称色谱峰及对称因子的计算 a.拖尾峰，b.前延峰，c.对称因子的计算 四、保留值四、保留值 1死时间t1死时间tM M 不被固定相吸附

10、或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰 极大值所需的时间称为死时间，如图1-1中 OA。因为这种物质 不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相 近测定流动相平均线速时，可用往长L与tM 的比值计算。 2保留时间t2保留时间tR R 试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称 为保留时间，如图1-1 OB它相应于样品到达柱末端的检测 器所需的时间 图图1-1 3 3调整保留时间调整保留时间调整保留时间调整保留时间t t R R 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留调整保留 时间时间，即，即 t t R R = = t

11、t R R - -t t MM 由于组份在色谱柱中的保留时间tR 包含了组份随流动相通过柱子所 需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR 实际上是组份在 固定相中停留的总时间保留时间可用时间单位（如s）或距离单位（如 cm）表示。 保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流 动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检 定。 4死体积 V4死体积 VM M 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空 间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总 和当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流 动相体积流速F0 （Lmin）计算： 0 F

12、tV MM 5 5 5 5保留体积保留体积保留体积 保留体积 V V V V R R R R 指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的 流动相体积。保留体积与保留时间t。的关系如下： 6调整保留体积调整保留体积VR 某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留 体积，即： MRR VVV 0 FtV RR 7相对保留值7相对保留值2.1 某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比，称为相 对保留值： 1 2 1 2 1.2 R R R R V V t t 由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱 径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法 中，特别是气相色谱

13、法中，广泛使用的定性数据 必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保 留体积之比 . 选择因子选择因子选择因子选择因子 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其 它峰（i）对这个峰的相对保留值此时，ri/s 可能大于1，也可能小于 1。在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的 相对保留值作为重要参数。在这种特殊情况下，可用符号表示： 1 2 R R t t 式中tR2 为后出峰的调整保留时间，所以这时总是大于1的 。 五、区域宽度五、区域宽度五、区域宽度 五、区域宽度 色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色色谱峰的区域宽度是组份在色

14、谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色 谱操作条件的动力学因素度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：谱操作条件的动力学因素度量色谱峰区域宽度通常有三种方法： 1. 标准偏差标准偏差 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图1-1中EF距离的一半。 2. 半峰宽半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽，如图1-1中GH间的距离它与标准偏差的 关系是： 354. 2 2/1 W 3. 基线宽度W3. 基线宽度W 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图1-1中IJ的距 离它与标准偏差。的关系是： 2/1 7.1WW 4W 从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：从色

15、谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息： 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组 份的最少个数 根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析 根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据 1-4 色谱法分析的基本原理1-4 色谱法分析的基本原理 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完 全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两 相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是 两峰间虽有一定距离，如果每个

16、峰都很宽，以致彼此重叠，还是 不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为 决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和 动力学两方面来研究色谱行为。 一、分配系数一、分配系数K K和分配比和分配比k k 1分配系数K1分配系数K 如前所述，分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间 反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附 过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这 种分配的参数称为分配系数。它是指在一定温度和压力下，组分在固定 相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比，即 m s C C K 溶质在流动相中的浓度 溶质在固定相中的浓度 2.2.2.2.