《果糖-6-磷酸激酶(6-phosphofructokinase,PFK)试剂盒使用说明》由会员分享，可在线阅读，更多相关《果糖-6-磷酸激酶(6-phosphofructokinase,PFK)试剂盒使用说明（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、http:/果 糖 -6-磷 酸 激 酶 （ 6-phosphofructokinase， PFK） 试 剂 盒 使 用 说 明 微 量 法货 号 ： BC0535规 格 ： 100管 /96 样产 品 内 容 ：提 取 液 ： 100mL 1 瓶 ， 4 保 存 ；试 剂 一 ： 液 体 20mL 1 瓶 ， 4 保 存 ；试 剂 二 ： 粉 剂 1 瓶 ， -20 保 存 。试 剂 三 ： 粉 剂 1 支 ， 4 保 存 。试 剂 四 ： 液 体 1 支 ， 4 保 存 。产 品 简 介 ：PFK（ EC 2.7.1.11） 广 泛 存 在 于 动 物 、 植 物 、 微 生 物 和 培
2、养 细 胞 中 ， 负 责 将 果 糖 -6-磷 酸 和ATP转 化 为 果 糖 -1,6二 磷 酸 和 ADP， 是 糖 酵 解 过 程 的 关 键 调 节 酶 之 一 。PFK催 化 果 糖 -6-磷 酸 和 ATP生 成 果 糖 -1,6-二 磷 酸 和 ADP， 丙 酮 酸 激 酶 和 乳 酸 脱 氢 酶 进 一 步依 次 催 化 NADH 氧 化 生 成 NAD+， 在 340nm 下 测 定 NADH下 降 速 率 ， 即 可 反 映 PFK活 性 。试 验 中 所 需 的 仪 器 和 试 剂 ：紫 外 分 光 光 度 计 /酶 标 仪 、 水 浴 锅 、 台 式 离 心 机 、
3、可 调 式 移 液 器 、 微 量 石 英 比 色 皿 /96孔 板 、研 钵 、 冰 和 蒸 馏 水 。操 作 步 骤 ：一 、 样 本 的 前 处 理1、 细 菌 或 培 养 细 胞 ：先 收 集 细 菌 或 细 胞 到 离 心 管 内 ， 离 心 后 弃 上 清 ； 按 照 细 菌 或 细 胞 数 量 （ 104个 ） 提 取 液 体 积http:/（ mL） 为 500-1000： 1 的 比 例 （ 建 议 500万 细 菌 或 细 胞 加 入 1mL 提 取 液 ） ， 超 声 波 破 碎 细 菌或 细 胞 （ 冰 浴 ， 功 率 20 或 者 200W， 超 声 3s， 间 隔
4、10s， 重 复 30 次 ） ； 8000g 4 离 心 10min，取 上 清 ， 置 冰 上 待 测 。2、 组 织 ：按 照 组 织 质 量 （ g） ： 提 取 液 体 积 （ mL） 为 1:5-10的 比 例 （ 建 议 称 取 约 0.1g组 织 ， 加 入1mL提 取 液 ） ， 进 行 冰 浴 匀 浆 ； 8000g 4 离 心 10min， 取 上 清 ， 置 冰 上 待 测 。3、 血 清 （ 浆 ） 样 品 ： 直 接 检 测 。二 、 测 定 步 骤 ：1. 分 光 光 度 计 预 热 30min 以 上 ， 调 节 波 长 至 340nm， 蒸 馏 水 调 零 。
5、2. 样 本 测 定（ 1） 在 试 剂 二 瓶 中 加 入 17ml试 剂 一 和 1.13ml蒸 馏 水 充 分 溶 解 ， 置 于 37（ 哺 乳 动 物 ） 或 25 （ 其 他 物 种 ） 水 浴 5 分 钟 。 用 不 完 的 试 剂 4 保 存 一 周 。（ 2） 在 试 剂 三 中 加 入 1ml蒸 馏 水 充 分 混 匀 ， 冰 上 放 置 备 用 ； 用 不 完 的 试 剂4 保 存 一 周 。（ 3） 在 试 剂 四 中 加 入 1ml蒸 馏 水 充 分 混 匀 ， 冰 上 放 置 待 用 ； 用 不 完 的 试 剂4 保 存 一 周 。（ 4） 在 微 量 石 英 比
6、色 皿 或 96 孔 板 中 加 入 10 l 样 本 、 10 l 试 剂 三 、 10 l 试 剂 四 和 170 l 试 剂 二 ， 混 匀 ， 立 即 记 录 340nm 处 20s 时 的 吸 光 值 A1和 10min20s 后 的 吸 光 值 A2， 计 算 A=A1-A2。注 意 ： 不 同 匀 浆 组 织 中 PFK活 力 不 一 样 ， 做 正 式 试 验 之 前 请 坐 1-2个 预 实 验 ， 若 A0.5，则 说 明 活 力 太 高 ， 必 须 用 提 取 液 稀 释 成 适 当 浓 度 匀 浆 上 清 液 （ 计 算 式 中 乘 以 相 应 稀 释 倍 数 ） ，或
7、 缩 短 反 应 时 间 至 2min 或 5min， 使 A0.5， 以 提 高 检 测 的 灵 敏 度 。http:/PFK活 力 单 位 的 计 算 ：用 微 量 石 英 比 色 皿 测 定 的 计 算 公 式 如 下 ：1、 血 清 （ 浆 ） PFK活 力 的 计 算 :单 位 的 定 义 ： 每 毫 升 血 清 （ 浆 ） 在 反 应 体 系 中 每 分 钟 催 化 1nmol 果 糖 -6-磷 酸 和 1nmolATP转 化 为 1nmol 果 糖 -1,6-二 磷 酸 和 1nmol ADP定 义 为 一 个 酶 活 力 单 位 。PFK（ U/mL） = A V 反 总 （
8、d） 109 V 样 T=321 A2、 组 织 、 细 菌 或 细 胞 中 PFK活 力 的 计 算 :（ 1） 按 样 本 蛋 白 浓 度 计 算 ：单 位 的 定 义 ： 每 mg 组 织 蛋 白 在 反 应 体 系 中 每 分 钟 催 化 1nmol 果 糖 -6-磷 酸 和 1nmolATP 转 化为 1nmol 果 糖 -1,6-二 磷 酸 和 1nmol ADP定 义 为 一 个 酶 活 力 单 位 。PFK（ U/mg prot） A V反 总 （ d） 109 (Cpr V 样 ) T=321 A Cpr（ 2） 按 样 本 鲜 重 计 算单 位 的 定 义 ： 每 g组 织
9、 在 反 应 体 系 中 每 分 钟 催 化 1nmol果 糖 -6-磷 酸 和 1nmolATP转 化 为 1nmol果 糖 -1,6-二 磷 酸 和 1nmol ADP定 义 为 一 个 酶 活 力 单 位 。PFK（ U/g 鲜 重 ） A V反 总 （ d） 109 (W V样 V 样 总 ) T=321 A W（ 3） 按 细 菌 或 细 胞 密 度 计 算单 位 的 定 义 ： 每 1 万 个 细 菌 或 细 胞 在 反 应 体 系 中 每 分 钟 催 化 1nmol 果 糖 -6-磷 酸 和 1nmolATP转 化 为 1nmol 果 糖 -1,6-二 磷 酸 和 1nmol A
10、DP定 义 为 一 个 酶 活 力 单 位 。PFK（ U/104cell） A V 反 总 （ d） 109 (500 V样 V 样 总 ) T=0.642 AV反 总 ： 反 应 体 系 总 体 积 ， 2 10-4L； ： NADPH 摩 尔 消 光 系 数 ， 6.22 103L/mol/cm； d： 比色 皿 光 径 ， 1 cm； V 样 ： 加 入 样 本 体 积 ， 0.01mL； V 样 总 ： 加 入 提 取 液 体 积 ， 1mL； T： 反 应http:/时 间 ， 10min； Cpr： 样 本 蛋 白 质 浓 度 ， mg/mL； W： 样 本 质 量 ， g； 5
11、00： 细 菌 或 细 胞 总 数 ， 500万 。用 96 孔 板 测 定 的 计 算 公 式 如 下 ：1 血 清 （ 浆 ） PFK活 力 的 计 算 :单 位 的 定 义 ： 每 毫 升 血 清 （ 浆 ） 在 反 应 体 系 中 每 分 钟 催 化 1nmol 果 糖 -6-磷 酸 和 1nmolATP转 化 为 1nmol 果 糖 -1,6-二 磷 酸 和 1nmol ADP定 义 为 一 个 酶 活 力 单 位 。PFK（ U/mL） = A V 反 总 （ d） 109 V 样 T=642 A2 组 织 、 细 菌 或 细 胞 中 PFK活 力 的 计 算 :（ 4） 按 样
12、本 蛋 白 浓 度 计 算 ：单 位 的 定 义 ： 每 mg 组 织 蛋 白 在 反 应 体 系 中 每 分 钟 催 化 1nmol 果 糖 -6-磷 酸 和 1nmolATP 转 化为 1nmol 果 糖 -1,6-二 磷 酸 和 1nmol ADP定 义 为 一 个 酶 活 力 单 位 。PFK（ U/mg prot） A V反 总 （ d） 109 (Cpr V 样 ) T=642 A Cpr（ 5） 按 样 本 鲜 重 计 算单 位 的 定 义 ： 每 g组 织 在 反 应 体 系 中 每 分 钟 催 化 1nmol果 糖 -6-磷 酸 和 1nmolATP转 化 为 1nmol果
13、糖 -1,6-二 磷 酸 和 1nmol ADP定 义 为 一 个 酶 活 力 单 位 。PFK（ U/g 鲜 重 ） A V反 总 （ d） 109 (W V样 V 样 总 ) T=642 A W（ 6） 按 细 菌 或 细 胞 密 度 计 算单 位 的 定 义 ： 每 1 万 个 细 菌 或 细 胞 在 反 应 体 系 中 每 分 钟 催 化 1nmol 果 糖 -6-磷 酸 和 1nmolATP转 化 为 1nmol 果 糖 -1,6-二 磷 酸 和 1nmol ADP定 义 为 一 个 酶 活 力 单 位 。PFK（ U/104cell） A V 反 总 （ d） 109 (500 V样 V 样 总 ) T=1.284 AV反 总 ： 反 应 体 系 总 体 积 ， 2 10-4L； ： NADPH 摩 尔 消 光 系 数 ， 6.22 103L/mol/cm； d： 比http:/色 皿 光 径 ， 0.5 cm； V 样 ： 加 入 样 本 体 积 ， 0.01mL； V 样 总 ： 加 入 提 取 液 体 积 ， 1mL； T： 反应 时 间 ， 10min； Cpr： 样 本 蛋 白 质 浓 度 ， mg/mL； W： 样 本 质 量 ， g； 500： 细 菌 或 细 胞 总 数 ，500万 。
