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1、分类号： R114 单位代码： 10335 学 号： 20918242 硕 士 学 位 论 文 中文论文题目：中文论文题目：苯并芘诱导苯并芘诱导 HeLa 细胞细胞 DNA 损伤的核损伤的核 蛋白组学分析蛋白组学分析 英文论文题目：英文论文题目：Nuclear proteome analysis of benzo(a)pyrene treated HeLa cells 申请人姓名：申请人姓名： 陈 陈 曌曌 君君 指导教师：指导教师： 杨 杨 军军 教授教授 专业名称：专业名称： 卫生毒理学卫生毒理学 所在学院：所在学院： 浙江大学医学部公共卫生学院 浙江大学医学部公共卫生学院 论文提交日期论
2、文提交日期 2012 年年 1 月月 芘诱导芘诱导HeLa细胞细胞DNA损伤的核蛋白组学分析损伤的核蛋白组学分析苯并苯并 论文作者签名论文作者签名: 指导教师签名指导教师签名: 论文 评阅人 1： 胡虎/教授/浙江大学医学院 评阅人 2： 曾群力/教授/浙江大学医学院 评阅人 3： 吴南翔/研究员/浙江省医学科学学院 答辩委员会主席： 朱善宽/教授/浙江大学医学院 委员 1： 朱心强/教授/浙江大学医学院 委员 2： 华绍炳/教授/杭州德同生物科技有限公司 答辩日期： 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以
3、标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果， 也不包含为获得 浙江大学浙江大学 或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 浙江大学浙江大学 有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 浙江大学浙江大学 可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授
4、权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 浙江大学硕士学位论文 致谢 I 致致 谢谢 寒来暑往，春秋几度，转眼在浙江大学读研究生已经两年半了，回想往事， 仿佛一切就发生在昨天：忘不了收到入取通知书那天的明媚阳光；忘不了医学院 活动中心的那场圣诞晚会；忘不了蓝田2舍4041留下的欢声笑语；更忘不了实验室 与学习室走廊间急促的步伐和那几个通宵达旦的夜晚，因为有你们的陪伴，让我 研究生的生活充实多彩。 论文终于交给专家审查了，心里的一块大石头落地了，想起两年前的懵懂女 孩成长为今天的有志青年，我经历了太多，要感谢的人也太多，首先最应感谢的 是我的导师杨军
5、教授。本论文是在杨老师的悉心指导之下完成的。三年来，导师 渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德， 朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。导师不仅授我以文，更重要的是 教我做人，虽历时三载，却赋予我终生受益无穷之道。本论文从选题到完成，几 易其稿，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血，在此我向 我的导师杨军教授表示深切的谢意与祝福！ 感谢本人所在课题组的一群风华正茂的有志青年，他们不仅仅使我感受到科 研团队的力量，也使我感受到生活的充实和愉悦！尤其感谢闫春兰讲师、沈筱筠 讲师， 张广林、陈章辉、高向景、鞠莉、邵正萍和吴一华博士，卢静、干铁儿、
6、 唐倩、李焕荣、张潇云、李淑贤、肖素平硕士等在实验和学术上所给予的莫大帮 助！每每回想与这些同学们朝夕相处的往事，你们那种意气风发的精神，不由得 使我倍感鼓舞，谢谢你们，我亲爱的师兄弟姐妹！ 感谢我的父母，正是你们一直以来对我的细心呵护和不断鼓励，才使我勇敢 的面对人生中一次次的困难和挑战，最终取得今天的成绩。 感谢所有的朋友，是你们的支持、鼓励与鞭策，才使我今天能顺利的毕业。 感谢自己三年的辛苦付出。 最后，向所有直接或间接帮助过我的老师、同学，以及本文的评阅老师表示 感谢，谢谢您们！ 曌陈君 2011 年 12 月于浙江大学 浙江大学硕士学位论文 中文摘要 II 苯并芘诱导苯并芘诱导 He
7、La 细胞细胞 DNA 损伤的核蛋白组学分析损伤的核蛋白组学分析 浙江大学医学院浙江大学医学院 卫生毒理学卫生毒理学 硕硕 士士 研研 究究 生生 曌曌陈君陈君 导 师导 师 杨杨 军军 教授教授 中文摘要中文摘要 【背景】【背景】 多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）来源广泛，主要是由于有机 物的不完全燃烧所致，如垃圾焚烧、汽车尾气、熏制食品等，是一类重要的环境 和食品污染物。多环芳烃能够引起人体发生炎症反应、免疫系统功能下降、动脉 粥样硬化、癌症等，严重地威胁着人类的健康。作为最具代表性的多环芳烃，苯 并芘（benzo(a)pyrene,
8、BaP）具有很强的致癌毒性，常被作为研究多环芳烃致癌的 模式药物。它的致癌机制主要被认为是其活化代谢产物（BPDE）与DNA共价结合 形成DNA加合物5。一旦 DNA的损伤得不到及时的修复时，就会在复制过程中 造成基因突变或染色体畸变，最终促发癌症的产生。目前，有大量的研究深入探 讨BaP诱导DNA损伤应答的机制，并证实了许多与DNA损伤应答相关的蛋白，为 更好地了解BaP致癌的机理提供了重要的依据。 然而，这些研究大都集中于全细胞蛋白组学的研究，这往往会导致一些低丰 度的蛋白被忽视，如一些细胞核内的蛋白, 它们在调控致畸、致癌等细胞程序上起 到极为重要的作用。因此，使用亚细胞分离法或细胞器官
9、蛋白组学的方法来分析 蛋白（含低丰度蛋白）表达的改变就显得尤为重要。另一方面，考虑到DNA损伤 应答起始于细胞核内，会引起大量的核蛋白表达发生改变，因而，在本次研究中 我们主要观察不同浓度的BaP诱导HeLa细胞后，其核蛋白改变的情况。 浙江大学硕士学位论文 中文摘要 III 【目的】【目的】 为了更深入的了解BaP诱导的DNA损伤应答，发现可能的新机制，我们采用高 通量技术（双向电泳、质谱）全面了解BaP对HeLa细胞核蛋白表达的影响，鉴定并 验证BaP调控的相关蛋白，从而更深入的了解BaP诱导DNA 损伤应答的过程，为 DNA损伤应答及BaP诱导的癌症机理提供科学依据。 【方法】【方法】
10、1.不同浓度（0.1M、1M、10M）的 BaP 处理 HeLa 细胞 6h 后，提取细胞核蛋 白，并用 Bradford 法进行蛋白定量 2.双向电泳及质谱鉴定 3.对成功鉴定的蛋白进行查库（Swiss-Prot 数据库） ，并按功能对其进行分类 4.采用 siRNA 干扰、Western Blot 等技术对部分鉴定的蛋白的功能进行验证 【结果】【结果】 1、不同浓度的 BaP 处理 HeLa 细胞后，通过对比双向电泳结果发现：与对照组 相比，实验组中 125 个蛋白点有明显差异（79 个点下调，46 个点上调） 。最终经 质谱成功鉴定出 39 个蛋白。Western blot 验证部分蛋白
11、（ANXA1 和 NF-B） ，其 结果与双向结果一致。 2、采用 siRNA 干扰技术将 ANXA1 蛋白表达干扰后，BaP 诱导的 DNA 损伤 明显增加（H2AX 焦点明显增多） ；但对细胞凋亡的影响不大。 3、P28GANK 表达的下降引起 NF-B 在细胞核中的表达增加，同时在胞浆中的 量减少。 【结论】【结论】 1. BaP 处理可导致细胞核蛋白的表达的改变。 2. ANXA1 可降低 BaP 诱导的 DNA 损伤程度，起到保护的作用。 3. NF-B 通路可能参与 BaP 诱导 DNA 损伤应答。 浙江大学硕士学位论文 英文摘要 IV Nuclear proteome analy
12、sis of benzo(a)pyrene-treated HeLa cells School of Medicine Zhejiang University Toxicology Master degree candidate Chen Zhaojun Tutor Prof. Yang Jun Abstract 【Background】Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are common pollutants found in our daily living environments, which is mainly produced by
13、the incomplete combustion of organic materials, such as residential heating, refuse incineration and vehicle exhausts. As immunotoxic and carcinogenic environmental contaminants, PAHs exert various toxic effects toward human health, including carcinogenic, immunosuppressive, atherogenic, and inflamm
14、atory effects. BaP is a powerful carcinogen and has been used as a model chemical for PAHs. It is thought to cause cancer through covalent binding of its reactive metabolite(BaP-7,8-diol-9,10-epoxides, BPDE) to DNA, forming DNA adducts. Presently, the BaP-induced DNA damage response (DDR) has been e
15、xtensively studied, in an effort to understand the mechanisms of BaP-induced mutagenesis and carcinogenesis 5. However, most of these studies focus on whole-cell proteomic measures, one disadvantage of which is their limited ability to detect low-abundance proteins. Therefore, it is necessary to use subcellular fractionation, or organelle proteomics to identify changes in the expression levels of those lower-abundance proteins, such
