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1、摘 要 肠毒素大肠杆菌( E T E C ) 是引起婴幼儿和旅游者腹泻的主要病原菌。 C S 3 是E T E C的优势抗原之一，C S 3蛋白是形成 E T E C纤毛的结构亚荃单位。为 获得大量的 C S 3蛋白并研究其理化性质，构建了 C S 3的大肠杆菌表达载体 p Q E - C S 3 ， 在I P T G诱导下， 获得1 6 . 7 k D a 的蛋白， 诱导蛋白占 总蛋白 的5 3 . 8 %。 利用N i - N T A亲和层析一步获得大量的重组蛋白， 纯化蛋白量可达到 5 7 . 8 8 m 留 L a S D S - P A G E 分析表明， 复 性后纯化的蛋白 表现为
2、 梯状的 条带， 说 明C S 3 蛋白形成了一 系列的多聚体;在电镜下，可以观察到复性的 C S 3可以形成 丝状、类似纤毛状结构。G MI - E L I S A 检测结果表明，这种蛋白聚合物具有 与神经节昔脂G MI 结合的能力。 免疫霍乱毒素 B亚单位 ( C T B )或 C S 3可使人体对 E T E C的感染有保 护作用。为探索研制E T E C双组分亚单位疫苗的可行性，首先利用大肠杆菌 诱导 表达系统表达了C T B与C S 3 的融合蛋白 ( C T B / C S 3 ) 文献综述 二 影响植物生产外源蛋白的因 素 2 . 1提高外源重组蛋白 表达策略 利用植物作为生物反
3、应器生产重组蛋白大体可以分为四个步骤:( 1 )构建 植物表达载体和将目的基因转化到植物中;( 2 )获得再生植株和筛选转基因植 物;( 3 )从转基因植物中纯化目的蛋白;( 4 )鉴定获得的纯化蛋白。目前大多 数报道的工作集中在第一和第二部分，而对获得重组蛋白的提取和鉴定等下游 工作相对的报道较少。到目前为止，多种来源的重组蛋白己在烟草、西红柿、 矮牵牛、马铃薯、玉米、首楷、生菜和大豆等植物中获得表达。所表达的蛋白 分子量从0 .6 k D a I “ I 的小蛋白 到8 0 k D a 1i 1 的大蛋白。 可以说， 植物是一 个高容忍 度的生物，可以表达不同来源的蛋白、不同大小的蛋白。
4、但是，选择不同的植 物表达系统、 不同的来源的 基因， 积累的蛋白 水平差异很显著。 M a s o n 等( 1 9 9 2 ) 13 1利用烟草表达的乙型肝炎表面抗原的表达水平仅在 。 .0 0 6 6% T S P ; V e r w o e r d 等 ( 1 9 9 5 ) I l l利用烟草系统生 产A s e r g i l l u s n ig e ; 来 源的 植酸 酶， 其积累 水平达 到了1 4 . 4 % T S P 。 从目前的报道可以看到， 植物积累水重组蛋白水平达到1 %T S P 的 很少( 14 ,1 5 ,t6 1 。 因 此， 如何提高外源蛋白 表达是研究
5、植物反应器系统的一 个重点。 虽然目 前没有普遍的规律可循，但是有一些方面在提高植物生产外源蛋白时需 要考虑。 2 . 1 . 1 外源D N A整合和稳定性 高效重组蛋白合成的首要步骤是外源 D N A以最佳的数量和位置整合到植物 染色体上。绝大多数植物转化能够获得外源 D N A稳定整合的转基因植株。研 究表明外源基因在转基因植物中具有较好的稳定性。 V e r w o e r d等( 1 9 9 5 ) ( “ , 将植 酸酶基因 转入油菜， 植酸酶基因可以 稳定的遗传， 在第1 5 代的种子仍可以 检测 到植酸酶的表达。但是也有一些研究表明，外源基因在植物中会有基因沉默的 命运。这种基
6、因沉默现象大多数情况下是由于外源基因以多拷贝的形式插入到 植物基因组单个位点或多位点，由 于外源D N A与整合部位的D N A碱基组成不 同引起了 损害效应 ( d e t r im e n t a l e ff e c t s ) ，或者由于多拷贝插入过量表达n J i 许多外源 D N A失活有一个共同特征是存在重复地同源序列0 8 。另外外源 D N A甲基化与基因失活也有相关性，但是许多基因沉默如抑制作用不能检测出 外源 D N A 甲 基化。 P a r k等 ( 1 9 9 6 ) 1 9 认为同源序列导致地基因沉默是在转录 后发生的，而甲基化是发生在转录时或之前的。另一方面，在
7、启动子部分同源 序列引起的基因沉默发生在转录期，并且这种甲基化可以遗传。 防止或避免外源D N A失活， F i n n e g a n 等( 1 9 9 4 ) x “总结有以 下策略: 肠毒素大肠杆菌亚单位疫苗的研制 检测和选择带有单拷贝外源 D N A的转化植物; 发展单拷贝整合技术; 、:、J 11今1 了、 ( 3 ) ( s c a ffeI d 避免引入与转化植物有同源序列的外源基因; 在外源D N A序列旁加S A R a t t a c h m e n t r e g i o n s ) ; ( 4 )建立定点整合技术。 基因沉默现象是商业开发植物反应器的很大的障碍。也由此引
8、出一条标准: 获得商业用植株品系，不仅需要高效表达目的蛋白，同时能够稳定遗传外源基 因。 目 前，有许多理论可以指导外源D N A的整合和表达，但在实践上，仍需要 大量转化植物，通过筛选获得所需的植株。 2 . 1 . 2转录 转录可以说是在基因表达方面研究最透彻的。一般认为，提高转录水平会 增加蛋白质合成。因此，增加外源基因的转录是提高外源蛋白产量的一个重要 策略。 利用强启动子提高外源基因表达己有许多报道。 花椰菜花叶病毒( C a MV ) 3 5 S启动子是表达目 的蛋白 常用的强启动子，它是一个组成型的强启动子;2 0 1 人 们对 C a M V 3 5 S启动子进行了 许多 修饰
9、和改进，以 提高外源基因的 表达水平。 将 C a M V 3 5 S启动子的一些元件重复串联，可以 提高一些外源基因的表达水平 创。但是，通常来源于双子叶植物的启动子在双子叶中的表达效率比在单子叶 植物中高得多。因此，C a MV 3 5 S启动子在双子叶植物中的表达效率远远高于 单子叶植物，在利用单子叶植物作为生物反应器时所有的启动子就需要应用 A c t i n , U b i 和E m u 等起源于单子叶植物的启动子。 这种差异可能是单、 双子叶 植物基因表达的分子机制不同，或者是两者在转录和启动子序列识别方面有差 别。 非组成型启动子是指在特定诱导条件下，或特异性地在某些器官组织中启
10、 动目的基因表达。这类启动子可以避免了外源基因在植物的整个生长周期表达 所造成的能量浪费和外源蛋白对植物细胞正常生命活动的干扰。1 9 9 9年， T a c k a b e r r y等12 2 首次报道利用水稻谷蛋白启动子将人的巨 细胞病毒的抗原特异 的表达在烟草种子中，这样即使启动子强度不是太高，也能积累较高量的外源 蛋白:同时还利于加工和防止基因以花粉的形式扩散。 目前，在开发和研制植物诱导系统表达系统生产医药用的蛋白中，美国 C r o p T e c h 公司是这个新兴领域的“ 领导者” 。 C r o p T e c h 公司是1 9 9 2 年成立的， 文献踪述 公司致力于开发
11、和商业化利用遗传工程植物生产高价值蛋白质和生物化学制 品。他们开发了 一种收获后异源蛋白 表达系统M c G A - P h a r M系统。 M c G A启动 子是可诱导性的，其在正常生长条件下表现出非常有限的活性，在自 然的机械 作用 ( 植物组织的物理破坏或损伤)下启动。因此， 在 Mc G A启动子控制下的 目的基因，在收获后受到剪切或破碎的机械力诱导下基因表达，一般在2 4 h内 迅速合成蛋白质。高水平的生物活性的葡糖脑昔脂酶的转基因生产是这种可诱 导的表达效率的第一个证明12 3 1 2 . 1 .3转录后加工 转录后的修饰加工是细胞内蛋白合成的重要影响因素。与蛋白质表达水平 有
12、关的转录加工主要有m R N A前体加工，包括加帽、剪切和聚腺昔酸化; 内含子普遍存在于许多真核生物基因组内 2 4 1 ，在 m R N A前体加工中都会被 切除。 在动物和植物基因中内 含子影响基因的转录水平，这可能是由于内 含子 中 包含 着增强 子 序列能 够增加 表 达水平 12 5 1 , T o p f e r 等 ( 1 9 9 3 ) 证明， 在转化的 植 物 中外源基因带有内含子可以 增加m R N A的稳定性，从而提高了 外源蛋白的表达 量12 6 1 。在单子叶植物转化中内含子的应用成功的提高了外源蛋白的表达127 ,2 8 1 而对于双子叶植物转 化中 有内 含子 没
13、有增强作用的 报道。 T a n a k a等 ( 1 9 9 0 ) 12 9 1 报 道蓖麻种子催化酶基因的第一个内含子能提高转基因水稻中G U S的表达，而在 转转基因的烟草中没有增强作用。 多聚腺昔酸位置也对 m R N A的稳定性有巨大的影响3 0 1 ，最终会影响到外源 蛋白 在植物细胞的表达。 R i c h t e r 等( 2 0 0 2 ) 13 1通过改变乙型肝炎表面抗原基因 3 端多聚腺昔酸序列，将乙型肝炎表面抗原表达水平提高了4 8 倍。 另外， 经鉴定一些特异的识别序列能够增加 m R N A的降解13 2 1 。如果要增加 外源蛋白的表达量，需要尽可能去掉这些序列
14、。 2 . 1 . 4 蛋白 质翻译 对于蛋白质翻译的第一步一 多肤链合成的起始，在真核细胞中有许多种模型 来解释(3 3 1 。而实践证明对于转基因植物， K o z a k序列这个模型是最有效的指导 外源基因的翻译的起始的模型13 4 1 。一般认为，多 肤链合成的起始是翻译的限速 步骤。多肤链合成的起始后，蛋白 质合成速度的限制因素是 t R N A数量。 这种 限制可以 运用改变外源基因密码子解决。M a s o n等 ( 1 9 9 8 ) 13 1 将大肠杆菌热不 稳定性肠毒素 B亚单位 ( L T B )进行人工改造，在基本不改变多肤序列的前提 下，根据密码子的兼并性选择植物偏爱
15、的基因序列。将人工改造的 L T B基因转 入马铃薯后检测L T B表达水平，与未经改造的转L T B基因的马铃薯相比较，其 肠毒素大肠杆菌亚单位疫苗的研制 表达水平增加了3 - 1 4倍，通过小鼠口服转基因植物实验证明，改造的抗原具有 和改造前一样的免疫原性。 R N A 的前导序列也会影响翻译效率。特别是与随机前导序列或无序序列相 比，病毒的前导序列可以大幅度提高重组蛋白在植物体内积累13 6 3 。也有报道， 植物R N A前导序列提高植物蛋白水平13 7 1 。为了最有效提高表达，需要根据不同 的基因选择前导序列，而没有普遍可以遵循的标准。 另外，某些特定调控序列也能增强翻译的效率。M
16、 a s o n等 ( 1 9 9 6 ) 在启动 子C a MV 3 5 S和目的基因L T B或N V C P之hl插入烟草蚀刻病毒 ( t o b a c c o e t c h v i r u s , T E V )的 5 , 非翻译引导序列，作为翻译增强子提高表达效率13 8 1 。烟草花 叶病毒R N A的i 2 序列，增强m R N A的翻译效率13 9 1 因为在细胞内氨基酸水平是受调控的， 它们也有可能成为限制性因素14 0 ,4 11 例如，当大豆中引入外源蛋白富含甲 硫氨酸，大豆体内含甲 硫氨酸的蛋白表达 量就会降低;而在体外实验中，如果供给植物足够的甲 硫氨酸， 含有甲 硫氨酸 的蛋白表达量会提高。因此若要获得某种特殊蛋白的高水平表达，氨基酸合成 途径这个因素也需要考虑。 2 . 1 . 5 翻译后加工 翻译后的加工修饰，在很大程度上影响着最终蛋白 产物的质量和数量，但 是在报道植物基因表达中细节的分析都被省略了。许多例子都证明了植物可以 正确地加工外源蛋白，但也有非正确加工的例子 ( 表3 ) e 在一些报道中，重组
