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1、第二军医史学 硕士掌位论文 肝纤维化进程相关m i c r o R N A 表达谱的筛选 S c r e e n i n go fM i c r o R N A sE x p r e s s i o nP r o f i l ei nt h e P r o c e s so f H e p a t i cF i b r o s i s 研究生姓名许蜜蝶 专业名称病理学与病理生理学 导师余宏宇教授主任医师 导师组成员朱棵教授主任医师 刘惠敏教授主任医师 李维卿讲师主治医师 论文提交日期2 0 1 2 年3 月 论文答辩日期2 0 1 2 年6 月 培养单位第二军医大学长征医院病理科 - - 0
2、- - - - 年六月 j I I I II II I I III I1 II III II Y 2110 912 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明 的法律责任o 张准哆 学位论文版权使用授权声明 本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第 二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位 论
3、文全文或部分内容编入 8 h ) ； ( 2 ) 修剪组织成1 5 c m 1 5 c m 0 2 c m 块状，置入包埋盒； ( 3 ) 自动脱水机脱水浸蜡； ( 4 ) 包埋浸蜡制成组织蜡块； ( 5 ) 常温干燥贮存。 2 、苏木精书红( h e m a t o x y l i n - e o si n ，H & E ) 染色 ( 1 ) 将蜡块4 p m 连续切片，6 0 “ C 烤箱中烘烤固定3 0 m i n ，常温干燥贮存备用； ( 2 ) 自动H & E 染色仪染色； ( 3 ) 风干： ( 4 ) 中性树胶封片。 3 、马松( M a s s o n ) 染色 ( 1 ) 石
4、蜡切片脱蜡至水； ( 2 ) l 高锰酸钾氧化切片5 m i r a ( 3 ) 水洗，草酸漂白l m i m ( 4 ) 水洗，天青石蓝染5 m i n 水洗； ( 5 ) 摔去余液不用水洗，滴染M a y e r 氏苏木素3 - 5 m i n ；， ( 4 ) 流水洗涤5 1 0 m i n ； ( 5 ) 丽春红苦味酸饱和液染5 m i n ； ( 6 ) l 醋酸水溶液洗； ( 7 ) 1 磷钼酸分化切片约5 m i n ； 肝纤维化进程相关m i c r o R N A 表达谱的筛选 ( 8 ) 流水洗涤； ( 9 ) 1 淡绿或者甲苯胺蓝滴染3 0 s ； ( 1 0 ) 1 醋
5、酸水溶液洗切片； ( 1 1 ) 9 5 酒精分化； ( 1 2 ) 脱水、透明、封片。 4 、苦味酸一酸性品红( V a nG i e s o n ，v G ) 染色 ( 1 ) 石蜡切片脱蜡至水； ( 2 ) W e i g e r t 氏苏木素染核5 1 0 分钟； ( 3 ) 充分水洗至变蓝，必要时可分化； ( 4 ) V a nG i e s o n 氏液染色3 m i r a ( 5 ) 流水洗涤1 0 m i r a ( 6 ) 盐酸乙醇溶液分化； ( 7 ) 流水洗涤； ( 8 ) 脱水、透明、封片。 ( 四) 组织病理学观察 1 、H 娅染色结果判定： 肝细胞胞质淡染红色，胞
6、核蓝黑色，胶原纤维均质红染，未成熟胶原纤维中可见 大量梭形M F s 。 2 、M a s s o n 染色结果判定： 细胞核灰黑或蓝黑色，胶原纤维绿色，弹性纤维棕褐色，肌纤维红色。 3 、v G 染色结果判定： 胞核蓝黑色，胶原纤维红色，肌纤维黄色。 ( 五) 肝纤维化程度判断 根据2 0 0 8 年出版临床肝病诊断与治疗( 人民卫生出版社， I S B N 9 7 8 7 11 7 1 0 2 9 5 7 R 1 0 2 9 6 ) 中肝纤维化病理学分级标准进行分级： O 级正常肝组织，无纤维化： 1 级门管区扩大、纤维化，其周围纤维化但尚无纤维间隔形成； 2 级门管区周围纤维化，纤维间隔
7、形成，小叶结构完整； 第二军医大学硕士学位论文 3 级大多数门静脉区域纤维间隔延伸至邻近门静脉和肝的终末小静脉，纤维间隔形 成，小叶结构紊乱但是没有出现假小叶，无肝硬化； 4 级早期肝硬化或肯定的肝硬化，再生肝细胞结节由增生的纤维结缔组织完全包 绕，即假小叶形成，肝脏变小，变硬。 ( 六) 统计学分析 采用S P S S l 7 0 统计软件进行统计，实验数据统计结果以X S E M 表示；任意两 组之间比较采用L S D - t 检验，多组间大鼠肝体比水平比较方差齐性时采用单因素方差 分析( o n e w a yA N O V A 检验) ，方差不齐时应用K r u s k a l W a
8、 l l i s 检验，P O 0 5 有 统计学意义。 肝纤维化进程相关m i c r o R N A 表达谱的筛选 实验结果 一、大鼠一般情况变化 除2 只大鼠在造模过程第3 周死亡外，其余大鼠均按造模周期处死。最后进入实 验统计的大鼠阴性对照组3 只，模型组共1 8 只。 实验进行1 周后，与对照组相比，模型组大鼠体重开始下降( 表l - 1 ，图l - 1 ) 实 验第3 周开始，部分大鼠出现腹水。 表1 1各组大鼠实验前后体重肝重变化( X S E M ) 8 5 4 2 O 0l234 图1 1各组大鼠相对肝重明显减轻 r o u p n t g r o u p 2 1 - qe壹
9、口参J9皇口。嚆一篮 第二军医大学硕士学位论文 实验开始前各组大鼠活动、排便、体毛、体重无差异。至造模第7 天，与对照组 相比，模型组大鼠未出现形态和行为上的变化。由造模第1 0 天开始，与对照组相比， 模型组大鼠不再出现理毛行为，逐渐出现用力呼吸，活动减少，逐渐出现昏睡现象； 眼球颜色由鲜红逐渐暗淡，体毛暗淡，尿色变黄，饮食减少；进行腹腔注射时竖毛现 象和反抗能力逐渐减弱。 大鼠肝脏病理组织学改变 ( 一) 大鼠肝脏肉眼观察： 0W e e k 肝脏淡红色、质软、表面光滑有光泽、边缘锐、腹腔无腹水。 lW e e k 肝脏红色、质软或有肿大，表面欠光滑稍有光泽、边缘锐、腹腔无腹水。 2W e
10、 e k s 肝脏暗红色、质稍韧、体积稍大、表面欠光滑，边缘稍钝，无腹水 3W e e k s 肝脏暗红色、质偏韧、体积稍小、表面稍粗糙，边缘稍钝，有腹水 4W e e k s 肝脏暗红或黄色、质硬、体积缩小、表面粗糙、边缘钝，有腹水 ( 二) 大鼠肝脏镜下观察： 1 、各组样本肝纤维化分级由病理科医师进行判定，因肝纤维化为慢性延续性进程， 镜下肝脏可出现处于各分级之间的现象( 即可出现F O 1 ，F 1 “ - 2 ，F 2 3 ，F 3 “ - 4 ) ，故 肝纤维化程度判定标准为选取镜下大部分区域所属肝纤维化分级作为该样本肝纤维 化级别。 根据镜下观察结果，确立各周大鼠肝脏标本肝纤维化
11、程度，评分并分组( 见表 1 2 ) ，取F O 、F 1 、F 2 、F 3 、F 4 组纳入后续实验研究内容。 表1 2 大鼠肝纤维化程度分级评分 肝纤维化进程相关m i c r o R N A 表达谱的筛选 各级肝组织镜下观察结果： 对照组： F o 组肝小叶结构完整，小叶内肝板以中央静脉为中心向周围呈放射状整齐排列；肝 细胞大小均匀，核大且圆，核仁明显，胞浆丰富。 模型组： F l 组肝小叶结构完整，出现广泛的炎症反应( 充血、水肿、出血等) ，小叶内肝细 胞水样变性、个别凋亡小体形成，肝窦内k u p f f e r 细胞增生肥大，门管区纤维 稍增多，但未见小叶内纤维隔，即限于门管区
12、的圆形纤维化。 F 2 组肝小叶内肝细胞变性，小叶内及门管区仍可见少量炎性细胞浸润；门管区纤维 增生，部分向小叶内延伸而出现纤细纤维隔形成，但小叶结构尚完整。 F 3 组肝小叶内肝细胞变性，汇管区纤维明显增多，伴小叶内及小叶间纤维隔明显增 多，可有少量桥接纤维化出现而致肝小叶结构紊乱，但未形成假小叶。 F 4 组大量纤维隔形成，而致小叶结构完全破坏，形成假小叶。 第二军医人学硕上学位论文 图l 一2各级肝纤维化组织染色结果：A ：H E 染色；B ：m a s s o n 染色；C ：V G 染色 组I ：对照组( F 0 组) ；组：肝纤维化l 级( F 1 组) ；组I I h 肝纤维化2
13、 级( F 2 组) ； 组：肝纤维化3 级( F 3 组) ；组V ：肝纤维化4 级( F 4 组) 2 、此外，本实验H E 染色镜下观察显示：造模早期个别大鼠肝内可出现严重的小叶 内出血及坏死等改变。另外，部分肝组织内可观察到肝细胞脂肪变性。 肝纤维化进程相关m i c r o R N A 表达谤乎的筛选 图l 一3 大鼠H E 染色镜下观察：A ：肝小叶中心充血出血；B ：肝细胞广泛水样 变性；C - 炎性细胞浸润；D ：肝内少量坏死灶；E ：肝细胞脂肪变 - 2 5 第一二军医人学硕上学位论文 讨论 二甲基亚硝胺( d i m e t h y l n i t r o s a m i
14、n e ，D M N ) ) 是一种可溶于水、乙醇、乙醚等的 半挥发性有机化学毒物，具肝、肾强毒性，强致癌性和致畸性。因肝脏内含有微粒膜 结合酶和细胞色素P - 4 5 0 I I E l 等其代谢活化必需酶，故进入体内的二甲基亚硝胺主要 在肝脏进行代谢【1 】。 在肝内D M N 经微粒体代谢可产生甲醛、甲醇、烷化剂等含活性甲基化基团小分 子，引起核酸和蛋白质的甲基化，进一步导致肝细胞坏死与羟脯氨酸和丙二醛 ( M a l o n d i a l d e h y d e ，M D A ) 明显增J n 2 】，引起氧化应激脂质过氧化，诱发大鼠肝窦 壁H S C 的活化，导致其过量增殖和E C
15、 M 沉积，弓f 起肝纤维化形成【3 5 】；同时促进 窦内皮细胞形成肝窦毛细血管化，加重肝损伤，促进肝纤维化的发展 6 】。病理学表 现为随腹腔内注射周期延长的肝内纤维结缔组织逐渐增生和后期假小叶形成，与临床 肝纤维化病理特点相似，并且该模型具有肝纤维化形成率高、造模周期短、死亡率低、 肝纤维化病变相对稳定的特点，故常以D M N 连续腹腔注射S D 大鼠诱导肝纤维化模 型。目前这一模型已广泛应用于肝纤维化、肝硬化的机制研究以及药物筛选【7 】。 早期对D M N 诱导大鼠肝纤维化模型研究多着眼于其早期即可诱使H S C 活化和胶 原纤维形成方面【8 ，9 】。有研究显示，在D M N 诱导
16、的肝纤维化形成过程中，造模第 3 天肝内H S C 开始活化，细胞内脂滴逐渐减少，粗面内质网增加，开始向M F s 转化 并增殖；造模第7 一l O 天M - U s 开始填充纤维隔；第1 4 天开始即可在各门管区纤维隔 中观察到密集排列的M F s 1 0 。D M N 对H S C 有强大的促活化增殖作用，这一作用与 可诱使D N A 、R N A 和组蛋白等甲基化，T G F B 1 等生长因子促纤维化因子表达有关 【l l 】。而D M N 所致胶原纤维的短期内大量增殖也是其一大特点：造模早期即可观察 到胶原纤维大量增生，到第二周胶原I 和胶原I I I 的m R N A 表达量达到最高值，肝内 胶原纤维含量则随着注射周期延续持续增力n 1 2 ，1 3 1 。 本课题对大鼠通过腹腔注射D M N ，每周连续3 日，共进行4 周，可成功诱导体 内肝纤维化模型，在整个造模过程中，肝体比显著降低；对各时间段大鼠肝组织纤维 化程度行病理学检查，H & E 染色镜
