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1、福建医科大学 硕士学位论文 红细胞生成素对慢性肾衰竭大鼠内皮祖细胞动员和肾脏修复的 影响 姓名：杨霞 申请学位级别：硕士 专业：内科学（肾脏病） 指导教师：万建新 20100201 红细胞生成素对慢性肾衰竭大鼠内皮祖细胞动员和肾脏修复的 影响 摘要 目的研究促红细胞生成素( e r y t h r o p o i e t i n ，E P O ) 对慢性肾衰竭( c l l r o n i cr e n a l f a i l u r e ，C R F ) 大鼠外周血内皮祖细胞( e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e i l s ，E P C
2、s ) 的数目 和功能的影响，以及对肾脏的修复作用。 方法采用分阶段5 6 肾切除术制备大鼠慢性肾功能衰竭动物模型。实验动物随 机分为4 组：假手术组( C o n t r 0 1 ) ，慢性肾衰竭组( 模型组) 及r H u E P O 干预的 两个剂量亚组( 小剂量组和大剂量组) 。慢性肾衰竭大鼠皮下注射r H u E P O6 周 后，密度梯度离心法从大鼠心脏血中分离单个核细胞，接种于铺有纤维连接蛋白 的培养瓶内，给予含有血管内皮生长因子( V E G F ) 等的M 1 9 9 培养基。通过流 式检测细胞表面标记C D 3 4 ，C D l 3 3 和K D R 以及免疫荧光检测细胞内
3、吞U E A 1 和结合a c L D L 来鉴定E P C s ，并检测E P C s 增值、粘附及形成血管结构的能力。 用免疫组化检测肾组织C D 3 4 + 细胞数目、肾小球C A P 内皮细胞密度，用R T - P C R 检测肾组织e N O S 、E T l 、T G F 1 3 、C O LI Vm R N A 的表达，检测S c r 、B U N 、 尿蛋白指标并观察肾组织病理改变。 结果内皮祖细胞的鉴定用激光共聚焦显微镜观察，显示细胞D i I a c L D L 和 F I T C U E A 1 呈免疫双荧光阳性。应用r H u E P O 治疗能显著增加残肾模型大鼠 E
4、 P C 增值、粘附及形成血管结构的能力( P 0 0 5 。 3 2E P O 对5 6 肾切除大鼠2 4 h 尿蛋白的影响 于5 6 肾大部切除术后8 周检测各组大鼠2 4 h 尿蛋白及尿肌酐，发现模型 组2 4 h 尿蛋白、尿蛋白尿肌酐比值较C o n t r o l 显著增高( P O 0 5 ) ，应用r H u E P O 治疗后2 4 h 尿蛋白及其与尿肌酐比值较模型组显著降低( P 0 0 5 ) ( 见表4 ) 。因 此，我们认为E P O 可显著降低5 6 肾切除大鼠尿蛋白，对肾脏有保护作用。 表4 各组大鼠6 周尿蛋白及其与尿肌酐比值( 冤圭s ) 注：与C o n t
5、r o l 相比，叩 o 0 5 ；与模型组相比，P 0 0 5 。 3 3E P O 对5 6 肾切除大鼠H b 、H C T 的影响 于5 6 肾大部切除术后8 周检测各组大鼠H b 、H C T ，发现模型组H b 、H C T 较C o n t r o l 显著降低( P 0 0 5 ) ，应用r H u E P O 治疗后m 、H C T 较模型组显著增 高( P 0 0 5 ) ( 见表5 ) 。因此，我们认为应用亚临床剂量的r H u E P O 可显著增加5 6 肾切除大鼠H b 、H C T ，而不会使其血压进一步增加。 表5 各组大鼠6 周H b 、H C T ( i 士S
6、 ) 注：与C o n t r o l 相比，宰P 0 0 5 ；与模型组相比，P 0 0 5 。 3 4E P O 对5 6 肾切除大鼠血B U N 、血S e r 的影响 于5 6 肾大部切除术后8 周检测各组大鼠血B U N 、血S c r ，发现模型组血 B U N 、血S c r 较C o n t r o l 显著增高( P O 0 5 ) ，应用r H u E P O 治疗后血B U N 、血 S c r 较模型组显著降低( P 0 0 5 ) ( 如表6 ) 。因此，我们认为E P O 可显著降低5 6 肾切除大鼠血B U N 及血S c r 。 表6 各组大鼠6 周血生化检查结
7、果( i 士s ) 注：与C o n t r o l 相比，P O 0 5 ：与模型组相比，P 0 0 5 。 4 E P O 对5 6 肾大部切除大鼠残肾组织病理变化的影响 4 1 肾脏大体观察情况 C o n t r o l 组双肾大小正常，呈褐红色，质地坚实有光泽，切面正常；模型组 ：肛 葛肾明显增大，苍白色，质地坚硬无光泽，切面皮质明显变薄、皮髓质分界不清， 包膜增厚；小剂量组和大剂量组右肾轻度增大，浅褐色，质地较硬无光泽，切面 皮质变薄、皮髓质分界线可辨，包膜增厚。 4 2E P O 对5 6 肾切除大鼠肾组织病理变化的影响 于光镜下观察各组大鼠肾组织病理切片染色，模型组均肾小球系膜
8、细胞增 生、系膜基质增宽、肾小球毛细血管部分塌陷、球囊粘连、局灶节段性肾小球硬 化、部分小球完全硬化、细胞外基质显著增加，P A S 染色显示肾小球硬化，天狼 星红染色显示肾组织纤维化。结合5 6 肾大部切除术后8 周检测模型组大鼠血压、 2 4 h 尿蛋白、血C r 、血B U N 均显著增加，而H b 、H C T 明显降低，说明本实验 建立肾大部切除、进行性肾小球硬化的慢性肾衰竭大鼠模型是成功的。我们的实 验结果表明，E P O 可显著减轻能明显减轻慢性肾衰竭模型大鼠。肾脏病理损伤及 肾脏纤维化。 4 2 1E P O 对5 6 肾切除大鼠肾组织结构病理变化的影响 H E 染色是观察肾脏
9、组织大体结构常用的染色方法。C o n t r o l 组肾组织结构 整齐，肾小球、肾小管未见异常病变( 如图8 1 ) ；模型组可见肾小球萎缩严重， 系膜区弥漫性增宽，小管腔增大，髓袢偏髓质的近曲小管为主的上皮细胞空泡状 变性、肿胀，病变严重的部位肾小管上皮细胞脱落，肾组织结构紊乱，呈萎缩倾 向( 如图8 2 ) ；应用r H u E P O 治疗后，小剂量组肾脏病理损害程度减轻( 如图 8 3 ) ，大剂量组肾脏病理损害程度减轻更为明显，其肾脏组织结构接近C o n t r o l 组( 如图8 4 ) 。 ， 4 2 2E P O 对5 6 肾切除大鼠肾小球基底膜、小管结构变化的影响 P
10、 A S 阳性物质( 多糖和糖原) 呈紫红色，核呈蓝色。P A S 染色法是观察肾脏 结构，尤其是肾小球系膜、基底膜以及肾小管结构的主要方法。C o n t r o l 组肾小 球基底膜、肾小管结构完整( 如图9 1 ) ；模型组肾小球系膜、基底膜毁损，小管 结构破坏严重( 如图9 2 ) ；应用r H u E P O 治疗后，小剂量组肾小球系膜、基底膜 毁损及小管结构破坏程度减轻( 如图9 3 ) ，大剂量组减轻更为显著( 如图9 4 ) 。 2 7 露 目8 - 2 模型组( X 4 B ) l m 图B - 3 小剂量组( 帅) E 圈8 4 大莉量组( 柚) I I E 图9 - 1
11、( A ) C o n t r o l ( 4 0 )图9 - 2 ( A ) 模型组( 4 0 ) 图9 - 3 ( A ) 小剂量组( x 4 0 )图9 _ 4 ( ) 大剂量组( x 4 0 ) 3 5 3 0 2 5 蓦2 0 V 譬1 5 1 0 5 0 各组人鼠肾组织P A S 染色( B 1 1 囱 C o n t r o l 模型组小剂晕组大剂量组 圈9r H u E P O 对5 6 肾切除太鼠肾小球基底膜和肾小管结构变化的影响 罔注：阿A 为辞组太鼠肾组织P A S 染色罔片：圈B 为各纽 鼠肾组织P A S ( ) 分析 P ( o0 5 V S C o n t 3 1
12、 组：# P ( 0 0 5 V S 模型组。 F 辩 4 2 3E P O 对5 6 肾切除大鼠肾间质纤维化变化的影响 天狼星红染色胶原纤维呈红色，细胞核呈蓝色，余呈黄色。肾小管间质纤 维化是所有慢性肾脏疾病发展的晟终结果，是导致终末期肾功能衰竭的主要原因 之一。细胞外基质( E C M ) 在肾间质中过度沉积是肾间质纤维化的主要特征。 胶原纤维是E C M 主要成分之，定量测定肾脏皮质胶原含量，可以用来判断肾 脏间质纤维化程度。模型组肾间质纤维化、肾小球硬化程度较C o n t r o l 组明显增 加( P 00 5 ) ，应用r H u E P O 治疗后，小剂量组肾间质纤维化、肾小球
13、硬化程度 有所减轻大剂虽组减轻更为明显( P 00 5 ) ( 如图1 0 ) 。 圈l o - l ( ) c 。“叫( x 一4 0 ) 圈l 们( ) 模型组( 4 0 ) 图l f l - 3 ( A ) 小剂量组( x 4 0 )圈1 0 4 ( A ) 大剂量组( X 4 0 ) 芭 2 5 脚2 0 番1 5 翮 j 1 0 悠 H J 各组大鼠肾组织天狼星红染色( B ) C o n t r o l 模型组小剂量组大剂量组 图1 0E P O 对5 1 6 肾切除大鼠肾间质纤维化变化的影响 图注：图A 为各组大鼠肾组织天狼星红染色图片；图B 为各组大鼠肾组织天狼星红( ) 分析
14、，P 0 0 5V SC o n t r o l 组，押 0 0 5V S 模型组。 4 3E P O 对5 6 肾切除大鼠肾小球血管密度及C D 3 4 表达的影响 4 3 1E P O 对5 6 肾切除大鼠肾小球血管密度的影响 C D 3 1 是表达于血管内皮细胞表面的抗原，C D 3 1 免疫组化阳性的细胞呈颜 色较深的棕黄色颗粒，主要在肾小球内血管内皮表达。模型组肾小球中C D 3 1 表 达较C o n g t r o l 组显著减少( P O 0 5 ) ，应用r H u E P O 治疗后，小剂量组肾小球中 C D 3 1 表达有所增加，大剂量组增加更为明显( P 0 0 5 )
15、 ( 如图1 1 ) 。因此，我们 认为E P O 可使肾小球血管内皮细胞增多，使其毛细血管密度明显提高。 4 3 2E P O 对5 6 肾切除大鼠肾脏中C D 3 4 表达的影响 C D 3 4 主要表达于小血管内皮细胞，是一种与新生小血管相关的抗原，由 于其在新生血管内皮中表达远大于非新生血管内皮，提示其作用可能与血管生成 有关，主要在肾小球内血管内皮表达。亦选择性表达在肾小管上皮细胞的细胞质 内和细胞膜上，形态上为细颗粒性树突状，呈较深棕黄色。模型组肾组织C D 3 4 表达较C o n g t r o l 组显著减少( P 0 0 5 ) ，应用r H u E P O 治疗后，小剂量
16、组肾组织 中C D 3 4 表达有所增加，大剂量组增加更为明显( P o 0 5 ) ( 如图1 2 ) 。因此，我 们认为E P O 可使5 6 肾大部切除大鼠肾组织中新生小血管增多。 鬻 j 鬈：譬? 耋，：蠢+ i 。j ：每 、? 水强一。 圈1 1 - 1 ( A ) C o n t r o l ( 帅) 圈1 1 2 ( A ) 模型组( 帅) 、L 圈1 1 - 3 ( A ) 小剂量组( 4 0 ) ! 裂：餮 i 0 、喜誉黔萋 ：；：o ，一、： 1 一j 。“o 一，、 ：1 。二，t o 、1 。鬈；t ：j ：。蠢 口：1 。：i ：二二： 各组大鼠c D 3 l 表达( B C o n o I 模型组小剂量组大剂量组 图Ur H e E P O
