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1、分类号 华中农业大学硕士学位论文 1 8 3075l 密级 红色红曲菌交替氧化酶基因M r a o x l 克隆与功能初步研究 C l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft h eM r a o x lg e n e f r o mM o n a s c u sr u b e r 研究生：李琦 指导教师：陈福生教授 专业：微生物学 获得学位名称：理学硕士 研究方向：食品微生物学 获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学食品科学技术学院 二。一O 年一月 f 煳烟弋 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 界
2、 如需保密，解密时间年 月 日 是否保密口 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：李予参 时间：知f D年月2 乡日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论
3、文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密，商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 溉黼始李琦 翩鲐修列 签名日期：如I 口年f 月万日 签名日期a 。( 。年月生托 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 红色红曲菌交替氧化酶基因M r a o x l 克隆与功能初步研究 目录 摘要I A B S T R A C T 缩略语表V 第一章文献综述1 1 红曲菌一1 1 1 红曲菌的分类1 1 2 红曲菌的主要代谢产物1
4、1 2 1 色素1 1 2 2 莫呐可林K 2 1 2 3 丫一氨基丁酸2 1 2 4 桔霉素2 1 3 红曲菌的分子生物学研究3 1 3 1 分子标记技术在红曲菌分类中应用3 1 3 2 红曲菌遗传转化方法的研究4 1 3 3 红曲菌功能基因的研究4 2 交替氧化酶5 2 1A O X 的结构6 2 2 交替氧化酶的功能7 2 2 1 生物产热7 2 2 2 清除活性氧和抑制细胞凋亡8 2 2 3 调节代谢平衡8 2 2 。4 增强抗逆能力8 2 3 丝状真菌A O X 的研究8 3 丝状真菌基因功能研究的方法9 3 1 随机插入突变9 3 2 基因敲除9 3 3R N A 干扰1 0 3
5、4 过表达1 0 4 研究目的与意义1 1 第二章红色红曲菌M 7 的M r a o x l 的克隆及其序列分析。1 2 1 材料12 论文 l ：! 1 ：! 1 ：! 1 ：! 1 ：； 1 ：； 片段的克隆1 3 1 ：； 1 3 1 4 1 4 1 4 15 1 1 ； 11 ； 1 6 1 6 3 1M r a o x l 基因片段的克隆1 6 3 2M r a o x l 基因片段的侧翼序列延伸1 7 3 3 序列拼接及分析1 8 3 4M r a o x l 的氨基酸序列同源性与保守性分析。1 9 3 5M r a o x l 的转运肽预测2 0 4 小结与讨论2 1 4 1d
6、、结2 1 4 2 讨论2 2 第三章M r a o x l 基因的敲除2 4 1 材料2 4 1 1 菌株与质粒2 4 1 2 主要试剂2 4 1 3 农杆菌介导的转化所需试剂和培养基。2 4 1 4 主要仪器与设备2 5 2 方法。2 5 2 1 敲除载体的构建2 5 红色红曲菌交替氧化酶基因M r a o x l 克隆与功能初步研究 2 1 1 构建M r a o x l 的敲除盒2 6 2 1 2 构建M r a o x l 基因敲除载体2 7 2 2 敲除载体转化农杆菌2 8 2 2 1 农杆菌感受态的制备2 8 2 2 2 农杆菌的转化2 8 2 3 农杆菌介导的红曲菌转化一2 8
7、 2 3 1 红曲菌孢子的收集2 8 2 3 2 农杆菌的诱导2 9 2 3 3 红曲菌孢子与农杆菌共培养2 9 2 3 4 转化子的筛选2 9 2 4 敲除子的筛选和验证2 9 2 4 1P C R 方法筛选红曲菌A M r a o x l 突变子2 9 2 4 2S o u t h e r n 杂交验证A M r a o x l 突变子3 0 3 结果3 0 3 1 敲除盒的构建3 0 3 2M r a o x l 敲除载体的构建及验证3 1 3 3 敲除载体p K A O X l 转化农杆菌3 2 3 4 红色红曲菌M 7 的A M r a o x l 突变子的P C R 筛选与验证3
8、2 3 5 红色红曲菌M 7 的A M r a o x l 突变子的的S o u t h e r n 杂交验证3 2 4 小结与讨论3 4 4 1 小结3 4 4 2 讨论3 4 第四章M r a o x l 功能的初步研究3 6 1 材料3 6 1 1 菌株3 6 1 2 主要试剂3 6 2 方法3 6 2 1 环境胁迫对M 7 和a M r a o x l 突变子的孢子萌发率的影响3 6 2 1 1 双氧水对孢子萌发率的影响3 6 2 1 2p H 值对萌发率的影响。3 7 2 1 3 温度对孢子萌发率的影响3 7 2 1 4 渗透压对孢子萌发率的影响3 7 2 2c A M P 和柠檬酸对M 7 和A M r a o x l 突变子生长的影响。3 7 ， 4 1 ，J 、结4 4 4 2 讨论4 5 4 2 1M r
