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1、密 级： 学校代码：10075 分类号： 学 号：20091376 医学硕士学位论文 红景天苷对缺氧心肌细胞的保护作用及 其对线粒体ND4蛋白的影响 学位申请人：李志军 指 导 教 师 ：曹雪滨 教授 学 位 类 别 ：医学硕士 学 科 专 业 ：中西医结合临床 授 予 单 位 ：河北大学 答 辩 日 期 ：二一二年六月 Classified Index: CODE: 10075 U.D.C.: NO: 20091376 A Dissertation for the degree of M. Medcine The protect of Salidroside on Myocardial ce
2、lls in Hypoxia and the effects on Subunit 4 of NADH Candidate : Li Zhijun Supervisor : Prof. Cao Xuebin Academic Degree Applied for : Master of Medicine Specialty : Clinical way of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine University : Hebei University Date of Oral Examination : June, 2012
3、 摘 要 I 摘 要 心肌细胞的能量代谢是心脏活动的物质基础,线粒体是细胞能量代谢的核心部位， 线 粒体内膜上存在多种酶与辅酶组成的电子传递链，电子从 NADH 或 FADH2 向氧传递， 形成粒子型氧，再与质子结合生成水，放出的能量则使 ADP 磷酸化生成 ATP。缺氧可 以导致线粒体呼吸链功能障碍。呼吸链主要涉及复合酶-，复合体包含 7 种线粒 体基因编码蛋白（包含 ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6 和 ND4L）。研究发现 ND4 蛋白的缺失可使复合体活性完全丧失、复合体活性丧失 50 %、复合体的活 性降至正常的 64 %。ND4 蛋白在线粒体呼吸酶链中有重要作用，其活性
4、的改变对线粒 体能量代谢有重要影响。本课题主要研究缺氧对心肌细胞线粒体 ND4 蛋白表达影响及 相关机制，并探讨中药单体红景天苷对其的影响机制。 目的：目的：观察红景天苷（Salidroside，Sal）对缺氧心肌细胞活性的影响，从心肌细胞 线粒体 ND4 蛋白方面探讨红景天苷对缺氧心肌细胞的保护作用及相关机制。 方法：方法：取新生 SD 乳鼠心脏，通过酶消化法获得乳鼠心肌细胞，以 5105/mL 密度 种板，待条件成熟后进行药物干预实验。心肌细胞共分为 4 组：对照组、缺氧模型组、 低剂量红景天苷干预组、高剂量红景天苷干预组。缺氧模型设计：厌氧产气盒厌氧产 气包低糖无血清 DMEM 培养基。
5、观察指标：1.倒置显微镜下观察心肌细胞形态变化； 2.MTT 法测定不同培养条件细胞存活率；3.应用分光光度计法测定不同培养条件细胞培 养基中乳酸脱氢酶（LDH）含量；4.应用分光光度计法测定复合物活性变化；5.应用 凝胶电泳法测定不同培养条件心肌细胞中脱氧核糖核酸 DNA 变化；6.应用苏木精-伊红 染色法观察不同培养条件心肌细胞细胞核变化； 7.应用 Westernblot 法测定不同培养条件 心肌细胞线粒体 ND4 蛋白的表达。 结果：结果：（1）倒置显微镜下观察发现，与对照组相比，高剂量红景天苷干预组细胞 凋亡数量较少（P0.05），缺氧模型组中最多（P0.01），有统计学意义。（2）
6、MTT 法测得缺氧模型组细胞存活率与对照组相比显著下降（P0.01），红景天苷干预组细胞 存活率较模型组明显上升，呈药物浓度依赖性（P0.01）；（3）缺氧模型组培养基中 LDH 含量与对照组相比显著升高（P0.01），红景天苷干预组培养基中 LDH 水平较缺 氧模型组下降，呈药物浓度依赖性（P0.01）；（4）缺氧模型组中心肌细胞线粒体复 摘 要 II 合体的活性与对照组相比明显降低，红景天苷干预组也降低，但与单纯缺氧模型组相 比，酶活性明显升高（P0.01）。（5）通过凝胶电泳法发现，缺氧模型组及低剂量红 景天苷干预组中出现 DNA 片段（DNA ladder）。对照组及高剂量红景天苷干预
7、组未见 明显 DNA ladder。 （6）HE 染色后发现，缺氧模型组及低剂量红景天苷干预组中可见大 量凋亡细胞（P0.01），对照组及高剂量红景天苷干预组未见明显凋亡细胞。（7） Westernblot 法测得，与对照组相比，缺氧模型组线粒体 ND4 蛋白含量明显下降，而红 景天苷干预组下降不显著（P0.01）。 结论：结论：1.采用厌氧产气盒厌氧产气包低糖 DMEM 培养基可成功制造缺氧模型； 2.缺氧可以损伤心肌细胞，导致细胞培养基中 LDH 水平升高、细胞存活率下降、线粒 体复合体活性降低、细胞 DNA 损伤、线粒体 ND4 蛋白表达下降；3.红景天苷可以减 轻缺氧对心肌细胞的损伤，
8、降低细胞培养基中 LDH 水平，提高细胞存活率，提高线粒 体复合体活性，减轻细胞 DNA 损伤、增强线粒体 ND4 蛋白表达，这种作用呈浓度依 赖性。红景天苷对心肌细胞的保护作用可能通过增强 ND4 表达，进一步维持线粒体呼 吸链的结构与功能实现对心肌细胞的保护作用。 关键词 红景天苷 心肌细胞 缺氧 复合体 ND4 蛋白 Abstract III Abstract The energy metabolism of cardiocytes is material basis in heart. The key process is the metabolism of ATP. Mitochon
9、drion is the key organelle about energy metabolism in cells.The respiratory chain of mitochondrial inner membrane is composed of coenzymes.The electron was transmited to O2 by electron transport chain.In the hole process,H2Oand ATP were produced.The major coenzymes in respiratory chain were Complex,
10、and .The Complexwere composed with 45 subunits that encoded by mitochondrial genes and karyogene. NADH dehydrogenase subunit 4(ND4)is the most important constituent of Complex. Evidence shows that the lack of ND4 protein have little effect about the structure of Complex. Inverse,the activity of Comp
11、lexwere lost completely , the activity of Complexwere lost by 50 %，the activity of Complex were lost to 64 %.Furthermore, it hinder the assemble process of Complex.So,the ND4 protein was very important in energy metabolism of cardiocytes.In this experiment,the ND4 protein was research and the relate
12、d mechanism of action were discussed. Objective:Observe the effection of Salidroside to the hypoxia cardiocytes and study the mechanism of action with the ND4 protein. Methods: First, get the hearts out of 20 healthy rats that bore in 24 hours. Digest the hearts with trypsase and obtain cardiocytes
13、in vitro. Culture cells in 6 and 96 wells plates. Start the experiment when the cells spread and contact with each others.the cells were divided into four groups, control group, model group , hypoxiasalidroside(50g/mL)and hypoxia salidroside(100g/mL). The mode design, GENbox anaer, Anaero Pack and l
14、ow glucose culture medium with no FBS.The indexs determined were cellular morphology, vitality of cells, LDH of liquid supernatant, activity of complex, the change of DNA and cell nucleus, the content of ND4 protein. Results: (1)Observed cells under microscope, compared with control group, hypoxia s
15、alidroside(100g/mL) group have few apoptosis cells （P0.05） and the apoptosis cells were most in model group（P0.01）.(2) The cytoactive were detected by MTT.Result show that the cells activity in model group were lower than control group cells（P0.01）.The level of cytoactive rose up after adding salidr
16、oside with different content. (3)The level of LDH in Abstract IV model group rose up observably compared with control group（P0.01）, the level of LDH descend after adding salidroside with different content. (4)The activity of complexwas least and in control group was most （P0.01） . (5)In gel electrophoresis,DNA ladders were emerge in model group and hypoxiasal
