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1、东北林业大学 硕士学位论文 繁殖季节雌性梅花鹿主要生殖激素变化规律的研究 姓名：田长永 申请学位级别：硕士 专业：野生动物保护与利用 指导教师：马泽芳;李和平 20040601 摘要 为了进一步的探索梅花鹿的生殖内分泌机制本论文对雌性梅花鹿在断乳后和发情前 后两个时期【0 L 清中四种主要生殖激素( 促卵泡索F S H 、促黄体素1 H 、雌二：醇岛和孕酮P ) 进 行了测定分析。 试验1 二2 0 0 2 年8 月2 2 日，在吉林松花湖鹿场进行。试验中，挑选了3 头，9 8 年出生、 健康的雌性梅花鹿作为试验鹿，并对其进行头部静脉采血，采血时期分为断乳后( 8 月2 2 日 至1 0 月3
2、 日) 和发情前后两时期( 发情前第1 6 d 至发情后第6 d ) 。在两时期中，采得血样中的 F S H 、L H 、I j ：和P 四种激素，通过放射性免疫分析方法( R I A ) 进行了测定分析。分析结果表 明： 试验鹿在断乳后的2 4 4 d 内，F S H 、u 、E 。和P 含量变化范围分别为l - 1 9 2 7 3 m I U m 1 、 2 3 7 5 6 7 m I U m l 、1 0 4 3 4 5 5 p g m l 和0 3 7 0 6 7 n g m l ，分别平均为2 0 1m I U m l 、4 6 6 m I U m l 、4 4 7P g m l 和
3、0 4 8 n g m 1 。 在断乳的这段时间内，试验鹿血清中F S H 含量在第8d 时，出现明显的峰( 2 7 3 O 1 4 m I U m 1 ) ，明显的高于两个峰底一断乳的第5 d ( 1 1 9 0 6 4 m l U m l ，p O 0 5 ) 。P 含量由第2 d 的0 6 7 o 0 5 n g m l ，在第1 l d 时，明显的下降到 0 4 5 0 0 6n g m l ( p O 0 5 ) 。 试验鹿在发情前的1 6 d 到发情后的6 d 内，F S H 、L t t 、E 。和P 含量变化范围分别为2 1 2 - 2 9 l m I U m l 、5 2 8
4、 7 8 3 M U m l 、2 0 1 6 1 4p g m l 和O 4 3 0 8 4 n g m l ，分别平均为 2 6 2 m l U m l 、6 4 6 m l U m l 、3 3 8 p g m l 和0 6 1 n g m l 。 在发情前后的这段时间内，试验鹿血清中F S l 含量由发情前第1 6 d 的2 2 0 0 2 3 m l U m l ， 缓慢的升高到发情前第l O d 的2 8 9q - O 2 1 m l U m l ( p o 0 5 ) ；L H 含量由发情前的第4 d 的5 8 4 0 5 7 m l U m l ，开始缓 慢上升，到发情时达到峰
5、值( 7 9 3 1 4 2 m I U m l ，p - 0 1 m m 降水日数为4 5 d ，l O m m 降水日数为1 9 4 d ，降雪日数为5 4 7 d ，有积雪日数为1 0 3 9 d ，最大积雪深度为3 1 c m ，雷暴 出现的曰数为3 8 1 d ，雾日数为3 3 3 d ，冰雹出现的日数为2 1 d ，沙尘暴日数为0 1 d 。 总的来看，该区属于温带大陆性季风气候；四季分明，春季少雨干燥，夏季温热多雨， 秋季凉爽多晴好天气，冬季较寒冷，它是季节性繁殖鹿的典型生存环境。生活在该区的梅花 鹿在每年的9 月下旬到“月初发情，在次年的5 6 月份产仔，避开了多雨季节等不良环
6、境 的影响，对该区气候环境具有极强的适应性。 东北林业大学硕士学位论文 4 试验材料与方法 4 1 试验材料 4 1 - 1 试验鹿 2 0 0 2 年8 月2 0 日于试验鹿场选择9 8 年出生，健康温顺，且当年产仔并仍在哺乳的雌性 东北梅花鹿3 头，将其与仔鹿拨开，放入单圈中进行常规饲养；同时该时间也是雌鹿断乳的 时间：所选择的试验鹿出生和产仔情况见表4 - 1 。 表4 - 1 试验鹿出生和产仔情况 鹿耳号出生年产仔时间( 2 0 0 2 年) 断乳时间( 2 0 0 2 年) 2 6 2 4 9 0 9 8 年 9 8 年 9 8 年 6 月2 日 5 月2 6 日 6 月1 4 日
7、8 月2 0 日 8 月2 0 日 g 月2 0 日 4 1 2 试情鹿 在选择试验鹿同时，选择健康，性欲旺盛的4 - 6 锯雄性梅花鹿2 头，做为试情鹿，放入 单圈中进行常规饲养。 4 1 3 试验仪器和设备 4 1 3 1 血样采集和保存仪器设备 吊圈( 鹿场自制，见附图) 、医用一次性注射器( 5 m 1 ) 、滴针( 9 号) 、普通玻璃试管、离 心机和冰柜( 4 0 ) 4 1 3 2 放射免疫分析仪器设备 S N 一6 9 5 B 型智能放免Y 测定仪( 上海日环光电仪器有限公司) D D L 。5 型低温离心机( 上海安亭科学仪器厂) G B l l 2 4 1 8 9 电热恒温
8、水温箱( 上海医疗设备厂) Y B D X 3 0 0 0 9 3 A 膜式电动吸引器( 天津市医疗器械厂) 漩涡混台器( 上海医科大学仪器厂) 移液器2 0 2 0 0 9 l 和2 0 0 10 0 0 1 A U C M A 冰箱试管 繁殖季节雌性梅花鹿主要生殖激素变化规律的研究 4 1 4 放射免疫分析药品 本试验放免测定的激素有促卵泡素( F S H ) 、促黄体素( L H ) 、1 7 B 一雌二醇( E 2 ) 和孕酮 ( P ) 四种，所用药盒均购自北方生物技术研究所，并均为同一批次( 2 0 0 2 1 2 ) ，每盒为1 0 0 管装，各药盒具体情况如下： 4 1 4 1
9、F S H 放免药盒 1 药盒组成 该药盒组成情况见表4 2 ： 表4 - 2F S H 放免药盒组成 F S H 系列标准品浓度分别为0 、2 5 、50 、1 0 、2 5 、5 0 和I O O m l U m l 。 2 技术指标 该药盒测定范围为2 5 1 0 0m l U l m l ，灵敏度小于1 Om l U m l ；批内变异小于1 0 ，批问 变异小于1 5 。 4 1 4 。2L H 放免药盒 1 药盒组成 该药盒组成情况见下表4 - 3 ： 表4 - 3L H 放免药盒组成 L H 系列标准品浓度分别为0 、5 0 、1 0 、2 5 、5 0 、1 0 0 和2 0
10、0 m I u m l 。 2 技术指标 该药盒测定范围为5 2 0 0m l U m l ，灵敏度为1 0m l U m l ；批内变异小于1 0 ，批间变 东北林业大学硕士学位论文 异小于1 5 。 4 1 4 3E 2 放免药盒 1 药盒组成 该药盒组成情况见下表4 - 4 表4 - 4 E 2 放免药盒组成 E 2 系列标准品浓度分别为0 、5 0 、2 0 、 2 技术指标 该药盒测定范围为5 4 0 0 0p g m l ，灵敏度为2 p g m l ；批内变异小于1 0 ，批间变异小于 1 5 。 4 1 4 4P 放免药盒 1 药盒组成 该药盒组成情况见下表4 - 5 ： 表4
11、 - 5P 放免药盒组成 P 系列标准品浓度分别为0 、0 2 、1 、3 、1 0 、3 0 和1 0 0 n g m l 。 2 技术指标 该药盒测定范围为0 2 1 0 0n g m l ，灵敏度为O 1 n g m l ；批内变异小于1 0 ，批间变异小 于1 5 。 2 4 4 2 试验方法 繁殖季节雌性梅花鹿主要生殖激素变化规律的研究 本试验过程可由图4 1 粗略描述；其具体操作过程见42l 425 。 8 月2 0 日一将仔鹿与雌鹿分开，停止仔鹿哺乳 情 每隔4 h 采血一次，5 m l 次 上 上 鹿!竺一悔恢一愀v臌 T T 验 至星 枷 试 谢 隋 F 发 衰 头 饲 舭，
12、 圈 单I l + 血 采 脉间隔为两天 静I I l I I l 审 OO匕早日月 率 帧间隔垄11天 剩上 换更月 东北林业大学硕士学位沦文 4 2 1 试情方法 于2 0 0 2 年8 月2 2 日开始到1 0 月2 9 目，对试验鹿进行雄鹿试情，以揭示雌鹿的繁殖状 态；试情方法参照中国梅花鹿( 秦荣前，1 9 9 4 ) 所捕述方法。试情绿灭2 次，时间分别为 早上6 ：0 0 和下午4 ：0 0 。 4 2 2 血样采集 血样采集划分为断乳至发情前阶段和发情前后阶段两个时期。断乳至发情前时期为自8 月2 2 日开始至第一头鹿发情前数天为止( 1 0 月3 日) 。发情前后时期为试验鹿
13、发情前第1 6 d 到发情后第6 d 。 由于两个时期具有明显的连续和重叠特性，故在血样采集时问上是连续的。 血样采集开始于2 0 0 2 年8 月2 2 日，至2 0 0 2 年1 0 月2 9 日结束；期间每问隔2 d 或3 d ， 在早上7 ：0 0 对试验鹿进行面部静脉采血5 m ，其具体安排见表4 - 6 。 表4 - 6 血样采集时问 时间鹿头数( 头) 采血间隔( d )采血量( m 1 ) 8 月2 2 日曲月5 日3 3 s 9 月5 日l O 月2 9 日3 2 5 在上述采血时间内，试情过程中若发现试验鹿发情，则对其进行连续2 4 h 采血，血样采 集频率为每4 h 一次
14、，采血量为5 m l 。 4 2 3 廓清制备 采得血样，在室温条件下静止5 6 h ，待其充分凝固，经1 5 0 0 r p m 离心3 0 m i n ，吸取上清 放入试管中，编号后，置于4 0 “ 0 f - , 箱中保存备用。 4 2 4 激素的放免测定方法 本试验对试验鹿血清中的F S H 、L H 、E 2 和P 浓度进行了测定，测定工作是在解放军总 医院采用S N 一6 9 5 型智能放免Y 测定仪完成，并自动打印测定结果。 4 2 4 1F S H 的放免测定方法 1 试剂配制 】) 抗血清和I - F S H 分别用1 0 m l 蒸馏水溶解： 2 ) 择试剂使用前摇匀。 繁
15、殖季节雌性梅花鹿主要生殖激素变化规律的研究 2 测定步骤 取试管若干，列其进行编号，包括N S B 、S o s 6 和样品管，然后按照表4 - 7 ，对各管进行 加样。 表4 7F S H 测定中的) J 1 1 样顺序 * 位：u 注：N S B 为空白管( 加0 标准品) ：S 矿- S 6 为0 至6 标准管 加样后摇匀各管，3 74 C 放置过夜( 1 6 2 4 h ) ；然后，各管分别加入5 0 0 H 1 分离剂，摇匀， 室温放置1 5 m i n ，采用S N 6 9 5 B 型智能放免Y 测定仪测定总计数率。接着3 5 0 0 r p m 离心1 5 r a i n ， 吸取上清；测定各管沉淀放射性计数率( C P M ) 。 3 F S H 标准曲线的绘制和血清F S H 浓度的计算 该标准帅线采用l o g i t 制图法( 标准曲线直线化法) 来绘制，通过该标准曲线永计算样l 疆中 F S H 的浓度。该过程在本试验中是由S N 。6 9 5 B 型智能放免Y 测定仪自带的计算机程序来完成， 其采用的方法如下； 1 1 结合率的计算 B 最、( ) ：B ( c m p ) - N S B ( c m p ) 1 0 0 ”、7 B o N S B 其中，B 为各标准管或样品管计数；B 。为S 。管
