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1、福建医科大学 硕士学位论文 糖基化终产物对人肾小球系膜细胞纤维化相关因子表达的影响 姓名：冯敏 申请学位级别：硕士 专业：内科学（内分泌与代谢） 指导教师：黄国良;陈瑶 20100301 糖基化终产物对人肾小球系膜细胞纤维化相关因子 表达的影响 中文摘要 目的探讨体外培养条件下糖基化终产物( A G E s ) 对人肾小球系膜细胞 ( H R M C ) 增殖以及转化生长因子一1 3 1 ( T G F 1 3 1 ) 、结缔组织生长因子( C T G F ) 及 纤维连接蛋白( F N ) 表达的影响及其可能的作用机制。 方法采用体外人肾小球系膜细胞系的培养方法，同时并制备糖化牛血清白蛋白
2、( A G E B S A ) ，分别用不同浓度的A G E B S A 作用相同时间和同一浓度的 A G E B S A 干预不同时间。四唑盐比色试验( M T T ) 法测定细胞的生长情况；蛋 白质免疫印迹( W e s t e r nb l o t t i n g ) 方法检测细胞中R A G E 的蛋白表达；半定量逆 转录聚合酶链反应( R T 。P C R ) 方法测定细胞T G F 一1 3 1 、C T G F 和F N 的m R N A 水平； 酶联免疫吸附试验( E L I S A ) 方法测定细胞上清液中的T G F 1 3 1 蛋白含量。 结果 ( 1 ) 不同浓度的A
3、G E B S A 干预系膜细胞4 8 h 和2 0 0 m g L 浓度的A G E B S A 干预系膜细胞不同时间后，系膜细胞均明显增殖，A G E B S A 各干预组与空白对 照组、相同浓度的B S A 组或相同时间点的B S A 组比较有显著性差异( 尸锄0 5 ) 。 ( 2 ) 在人肾小球系膜细胞中存在少量R A G E 的表达，A G E B S A 能够诱导系膜细 胞中R A G E 的表达增加；在加入不同浓度的A G E B S A 4 8 h 后以及J J - 1 x , 2 0 0 m g L 的 A G E B S A 作用不同时问后，T G F 1 3 1 、C
4、T G F 和F N 较空白对照组和相应浓度或时 间的B S A 组均明显升高( 尸 0 0 5 0 g 0 日 D 7 06 趔 吕0 5 趔0 4 越 采D 3 昏 0 2 0 1 0 D 5 口10 0 2 f i n 4 D 口 A G E s ( m g L ) 图l 不同浓度的A G E B S A 对系膜细胞增殖的影响 2 A G E B S A 作用不同时间对系膜细胞增殖的影响 以2 0 0 m g L 的A G E B S Af i - , 4 j 系膜细胞， 作川0 、1 2 、2 4 、4 8 、7 2h ，彳i 同 时间点观察系膜细胞增殖的情况。结果发现，1 2 h 逐
5、渐升高，2 4 h 后持续增殖， 并于4 8 h 达到最高点，之后又呈平缓趋势，在7 2 h 时与4 8 h 点大致持平。A G E 。B S A 在一定条件下呈时间依赖方式促进系膜细胞的生长，相比之下，以无血清D M E M 培养液和B S A ( 浓度为2 0 0 m g L ) 作为对照作用系膜细胞，分别在各自时间点 相比没有明显差异，尸 口0 5 ，而A G E B S A 各干预组分别与相同时间点的D M E M 组和B S A 组比较有显著性差异，P o 0 5 0 日0 0 7 5 0 7 0 口6 5 酋旺6 0 吕1 “ 1 5 5 删o 5 0 蜊 采o 4 5 昏 o4
6、0 0 3 5 0 3 0 2 44 B7 2 T i m e h ) 图2A G E B S A 干预H R M C 不同时间对细胞增殖的影响 1 6 讨论 。肾小球系膜细胞足肾小球内固有的一种血管外周细胞，是肾小球中功能最活 跃的细胞，同时也是。肾小球硬化发生过程中产生细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ， E C M ) 的主要细胞或称效应细胞【l O l 。J 下常情况下系膜细胞无明显增殖，而大量 研究表明该细胞在各种病理因素作用下被激活及发生表型转换后不仅促进自身 增殖、分裂，而且合成、分泌E C M ，还分泌多种炎症细胞因子和生长
7、因子、活 性物质等，如I L l 、I L 6 、T N F 叭P D G F 、T G F p 、内皮素、前列腺素等，这些 物质同时又会影响系膜细胞的增殖和分泌功能。系膜细胞发生异常增殖，同时伴 有系膜基质的增多，最终导致肾小球硬化。 A G E s 作为在高血糖条件下，非酶糖基化反应加速的产物，在D N 发病机 制中有着重要的作用。A G E s 可使肾小球基底膜成分交联增多，使蛋白更易透过 滤过膜，滤过的白蛋白堆积在系膜区可促进系膜细胞增殖及E C M 积聚。A G E s 也可以刺激肾脏固有细胞通过自分泌和或旁分泌方式合成及释放一些细胞因子， 影响肾脏细胞的增殖周期和代谢活性。 本研究
8、应用M T T 法检测了一定浓度范围A G E s 对系膜细胞生长情况的影响， 结果显示用不同浓度的A G E B S A 干预系膜细胞4 8 h 后，5 0m g L 的A G E B S A 浓度对系膜细胞的增殖影响没有显著差异，在A G E B S A 浓度达到l O O m g L 时， 系膜细胞增殖明显增加，随着A G E B S A 干预浓度的增加，系膜细胞生长速度加 快，1 0 0m g L 、2 0 0 m g L 、4 0 0m g L 的A G E B S A 浓度都能促进系膜细胞的增殖， 在浓度为4 0 0 m g L 时达到最大值。而分别以无血清D M E M 培养液和
9、含相同浓度 B S A 刺激同条件下的系膜细胞作为对照，则没有这种差异。结果提示一定浓度 范围内A G E B S A 呈浓度依赖方式促进系膜细胞的增殖。实验还发现在A G E B S A 浓度为2 0 0 m g L 时系膜细胞增殖的幅度最大，4 0 0 m g L 时增幅较小。由于所选浓 度点有限，更高浓度的A G E B S A 对系膜细胞的影响还不是十分明确。参照文献 并根据实验结果A G E B S A 浓度为2 0 0 m g L 时系膜细胞的增殖最明显，因此，选 择2 0 0 m g L 浓度的A G E B S A 干预系膜细胞观察一定时间范围内对系膜细胞生长 的影响，M T
10、T 法测定细胞在0 、1 2 、2 4 、4 8 、7 2h 不同时间点观察系膜细胞增 殖的情况。结果显示在1 2 h 时细胞生长逐渐升高，2 4 h 后持续增殖，并于4 8 h 达 1 7 到最高点，之后又呈平缓趋势，在7 2 h 时与4 8 h 点大致持平。提示A G E s 在一定 条件卜呈时f I J j 依赖力式促进系膜细胞的生长，柏比之下，以无血清D M E M 培养 液和含B S A ( 浓度为2 0 0 m g L ) 的无血清D M E M 培养液作为对照作用系膜细胞， 分别在各自时f a 】点相比没有明碌差异，而A G E B S A 各干预组分别与相同时问点 的D M E
11、 M 组和B S A 组比较有显著性差异，( 尸如0 5 ) 。 A G E s 引起系膜细胞增殖的机制尚未阐明，目前认为可能主要与A G E s 作 用系膜细胞后刺激产生和分泌细胞冈子有关。体外实验也证实A G E s 可以通过 T G F p 1 、P D G F 及V E G F 等细胞因子刺激系膜细胞增殖【1 1 1 。这些促增殖因子作 用于系膜细胞后，使胞内发生一系列生化改变，产生相应的第二信使。在基凶表 达发生长期变化之前，这些第二信使将首先激活一些即早反应基因，如早期生长 反应基因1 ( e g r - 1 ) 、e f o s 、e - j u n 等。许多促进系膜细胞增殖的因
12、子可以快速诱 导e g r - 1m R N A 的表达及蛋白合成，同时研究表明有丝分裂原促增殖作用的强弱 与诱导e g r - 1 表达的程度相平行【1 2 】。P D G F 、A G E s 、高糖也均可促进c f o s 和c - j u n 的表达，且其表达强度与系膜细胞增殖程度呈正相关【1 3 】。此外，Y a m a g i s h i 等【1 4 】 用三种不同的A G E s 干预体外培养的人肾系膜细胞，发现系膜细胞D N A 合成明 显降低，p 5 3 和B a x 蛋白表达显著增加，随后引起细胞凋亡，提示A G E s 可能通 过诱导系膜细胞凋亡来破坏肾脏固有细胞的稳态。
13、 本实验研究结果可能与其它研究略有差异，考虑可能与细胞系的不同有关。 我们的实验结果表明，A G E s 呈时间和浓度依赖方式促进人肾小球系膜细胞的增 殖，A G E s 通过促使系膜细胞增殖，从而导致系膜基质增多，最终导致肾小球硬 化，从而加快D N 的发生、发展。 第二部分A G E B S A 对人肾小球系膜细胞R A G E 及 T G F D 1 、C T G F 、F N 表达的影响 1 材料 1 1 细胞系 同第一部分。 1 2 主要试剂 材料和方法 试剂来源 琼脂糖 G o l d e n V i e w 核酸染料 T r i z o l 氯仿 异丙醇 D E P C ( 焦碳
14、酸二乙酯) T E M E D ( 四甲基二乙胺) S D S ( 十二烷基硫酸钠) 甘氨酸 T r i s 碱 脱脂奶粉 R A G E 兔抗人多克隆抗体 1 3 - a c t i n 鼠抗人单克隆抗体 辣根过氧化物酶标记的抗鼠或兔二抗 E C L 发光液 逆转录试剂盒 T G F - p lE L I S A 试剂盒 D N AM a r k e r ( D L2 0 0 0 ) 2x T a qP C RM a s t e r M i x ( 美国A m r e s c o 公司) ( 上海超研公司) ( 美国M B I 公司) ( 上海化学试剂厂) ( 上海化学试剂厂) ( 美国s
15、i g m a 公司) ( 厦门泰京生物公司) ( 厦门泰京生物公司) ( 厦门泰京生物公司) ( 厦门泰京生物公司) ( 厦门鹭隆生物公司) ( 美国S a n t a C r u z 公司) ( 美国S a n t aC r u z 公司) ( 中杉金桥生物公司) ( 厦门鹭隆生物公司) ( 美国P r o m e g a 公司) ( 武汉博士德生物公司) ( 日本T a k a r a 公司) ( 北京B i o m e d 公司) 1 9 1 3 主要仪器设备 仪器 来源 凝胶成像分析扫描仪( G e lD o e1 0 0 0 型) P C R 扩增仪( 2 7 2 0 型) 紫外分
16、光光度仪( U V2 1 0 0 型) 核酸蛋白定量测定仪( B i o m a t e5 ) 水平式核酸电泳仪( D Y Y _ 8 L 型) 电子天平 P H 计 恒温水浴箱 2 5 m l 培养瓶一 9 6 孔细胞培养板 立式压力蒸汽灭菌器 高速台式离心机( T G L 1 6 B ) 低温高速离心机( H S J 2 型) 倒置显微镜( 2 0 0 0 型) 超净工作台( S W - C J 1 F 型) 2 0 低温冰箱 8 0 低温冰箱 酶标仪( S t a tF a x 2 1 0 0 ) 醋酸纤维薄膜 水平式摇床( T H Z 0 3 2 ) W e s t e r nb l o t t i n g 电泳和转膜系统 其余见第一部分 ( 美国B I O R a d 公司) ( 美国A B I 公司) ( 日本S h i m a d z u 公司) ( 美困T h e r m o
