《类胰蛋白酶激活小胶质细胞PAR2介导的神经毒性作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《类胰蛋白酶激活小胶质细胞PAR2介导的神经毒性作用（66页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、蒡二彳鹰犬 硕士掌位论文 类胰蛋白酶激活小胶质细胞P A R 2 介导的 神经毒性作用 S t u d y o nt h eN e u r o t o x i cE f f e c t so fM i c r o g l i a lC e l l s A c t i v a t e db yT r y p t a s ev i aP A R 2 研究生姓名：陈成雯学号： 2 0 0 9 1 2 8 4 指导教师： 学科专业： 申请学位类别： 论文答辩日期： 本课题受 袁红斌副教授 麻醉学 临床医学专业学位 2 0 1 2 年5 月 上海市科委医学引导类基金( 项目号：11 4 11 9 a 4
2、 3 0 0 ) 国家自然科学基主( 蕞目号：8 l1 7 1 0 5 4 ) 资助 独创性声明 I I I II II I I III I 1I II II Il Y 2110 8 4 0 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责 任。 学位论文作者签名：谒，办y I J 签字日期： 加v 年吁月1 日 学位论文使用授权书声明 本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权
3、保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者张净函导师签名移I 式 签字日期：沙t 年竹月叫日 签字日期：t t 年寸月叫日 目录 摘 要l A b s t r a c t 4 缩略词表7 、j 一 翮 吾8 第一部分类胰蛋白酶激活小胶质细胞介导神经炎症反应10 一、材料与方法1l 二、结 果2 0一、；口 木，n 三、讨论2 9 四、结 论31 第二部分类胰蛋白酶激活小胶质细胞对
4、神经元存活的影响3 2 一、材料与方法3 3 二、结 果3 5一、乒口7 K 3S 三、讨论41 四、结论4 2 参考文献4 3 综述4 6 参考文献5 3 在读期间发表论文情况5 8 致谢5 9 类胰蛋白酶激活小胶质细胞P A R 2 介导神经毒性作用的研究 类胰蛋白酶激活小胶质细胞P A R 2 介导 神经毒性作用的研究 摘要 【研究背景及目的】 小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，其在维持中枢神经系统微环境的动 态平衡中扮演重要角色。近年来，研究认为神经元一小胶质细胞的神经网络失衡与神 经元损伤及中枢神经系统退行性疾病密切相关。其中，小胶质细胞活化后介导的神经 炎症反应和氧化损伤已成
5、为中枢神经系统疾病的研究热点之一。目前，越来越多的研 究证实活化的小胶质细胞可促进一氧化氮( n i t r i co x i d e ，N O ) 、肿瘤坏死因子a ( t u m o r n e c r o s i sf a c t o r a 。T N F a ) 等炎症因子的释放。然而，小胶质细胞活化的调控及其介导 神经炎症反应的分子机制十分复杂，尚待进一步研究阐明。 蛋白酶激活受体2 ( p r o t e a s e a c t i v a t e dr e c e p t o r2 ，P A R 2 ) 是与G 蛋白相偶联的受 体，属于蛋白酶激活受体( p r o t e a s
6、 e a c t i v a t e dr e c e p t o r s ，P A R s ) 家族成员之一，主要被 胰蛋白酶和类胰蛋白酶等激活，其独特的激活方式及广泛的病理生理作用，使其有望 作为重要的药物干预靶点而受到越来越多关注。近年来，研究发现P A R 2 广泛分布于 中枢神经系统，在中枢神经系统损伤和退行性疾病等病理过程中扮演重要角色。目前， 研究人员普遍认为在中枢神经系统中P A R 2 的激活可表现出“保护“ 和“损害的双 重作用，并推测其可能与细胞类型及疾病所处的病理阶段不同等因素相关，但具体作 用机制仍不明确。最近研究发现，胰蛋白酶可激活星形胶质细胞表面P A R 2 ，
7、通过 M A P K - N F r B 通路促进N O 的合成与释放。目前，针对小胶质细胞P A R 2 激活介导 神经炎症反应的研究还十分有限。我们前期研究中发现，活化的肥大细胞可释放类胰 蛋白酶激活小胶质细胞表面P A R 2 ，引起小胶质细胞活化，小胶质细胞活化后同样通 过M A P K 通路促进B D N F 的合成与释放。因此，我们推测外源性添加类胰蛋白酶可 激活小胶质细胞表面P A R 2 ，进而促进小胶质细胞合成和释放N O 、T N F a 等炎症因 子，介导神经炎症反应，导致周围神经元损伤。 综上所述，鉴于小胶质细胞在中枢神经系统免疫炎症反应中的重要作用，本课题 通过体外原
8、代细胞培养等技术，研究类胰蛋白酶激活小胶质细胞P A R 2 后不同时间点 N O 、T N F a 、I L 1 D 等炎症因子的释放情况，并观察其对体外培养神经元存活的影响， 旨在探索P A R 2 在小胶质细胞活化及其介导神经炎症反应中的作用，也期望为开发更 有效的中枢神经系统损伤防治新策略提供作用靶点，具有理论和临床意义。 第二军医大学硕士学位论文 【研究方法】 1 类胰蛋白酶干预小胶质细胞，检测不同时间点培养上清液中B D N F 、I L 11 3 、 T N F a 及N O 的含量 体外分离纯化培养大鼠皮质原代小胶质细胞，添加类胰蛋白酶( T u p t a s e ) 2 0
9、 U m l ，随后分别在第0 ，0 5 ，l ，2 ，1 2 ，2 4 和7 2h 收集小胶质细胞培养上清液( m i c r o g l i a c o n d i t i o n i n gm e d i u m ，M C M ) ，通过E L I S A 法检测上清液中B D N F 、I L - 1 p 及T N F 0 【 含量，G r i e s s 法测定上清液中N 0 2 “ 含量作为衡量N O 水平的指标。 2 利用P A R 2 特异性激动剂、抑制剂及R N A 干扰技术，探索P A R 2 在类胰蛋 白酶激活小胶质细胞介导炎症反应中的作用 体外分离纯化培养大鼠皮质小胶质
10、细胞，实验分4 组。对照组；实验组一：体外 培养小胶质细胞+ S L I G R L N H 2 ( P A I 也特异性激动剂) ：实验组二：体外培养小胶 质细胞+ F S S R Y - N H 2 ( P A R 2 特异性抑制剂) + T r y p t a s e ；实验组三：体外培养小胶 质细胞+ P A R 2s h R N A + T r y p t a s e ，2 4 h 后收集细胞培养上清液，G r i e s s 法测定比较 不同组别N O 水平。 3 类胰蛋白酶激活小胶质细胞对体外培养神经元存活的影响 体外分离培养大鼠皮质神经元，实验分3 组。对照组：体外培养神经元+
11、 未经 类胰蛋白酶处理的M C M ；早期组：体外培养神经元+ 类胰蛋白酶处理后第lh 收集 M C M ；晚期组：体外培养神经元+ 第7 2h 收集的M C M ，再培养神经元4 8h ，随后 通过流式细胞技术和T U N E L 染色检测神经元凋亡情况。 4 统计学处理 数据使用S P S S1 3 0 统计软件进行分析，结果以X S D 表示。多组间比较采用 单因素方差分析( o n e w a yA N O V A ) ，p 0 0 5 认为差异具有统计学意义。 【研究结果】 1 类胰蛋白酶干预早期B D N F 释放短暂性升高，晚期T N F a 等炎症因子含量逐 渐增加 检测结果显
12、示，类胰蛋白酶激活小胶质细胞后早期M C M 中B D N F 含量迅速增 加，在l h 释放达到高峰，但7 2 h 内逐渐下降至起始水平；与之相反，I L 1 p 、T N F Q 及N O 的含量则随时间推移逐渐升高，在最后一次测量时间点( 7 2h ) 仍保持较高水 平。 2 类胰蛋白酶通过激活小胶质细胞P A R 2 介导炎症反应 2 类胰蛋白酶激活小胶质细胞P A R 2 介导神经毒性作用的研究 P A R 2 特异性激动剂S L I G R L N H 2 显著增加小胶质细胞培养上清液中N O 的含量， 与对照组相比较差异具有统计学意义( 1 1 2 4 4 - 1 0 9V S2
13、 2 5 O 2 6 ，p 0 0 5 ；2 2 5 O 2 7V S2 2 5 0 2 6 ，p O 0 5 ) ，表明类胰蛋白酶是通过激活P A R 2 介导小胶质细胞 N O 的释放。 3 类胰蛋白酶干预晚期的M C M 促进体外培养神经元凋亡 流式细胞术检测结果：晚期组神经元凋亡率明显增加，与对照组和早期组相比 较差异具有统计学意义( 1 3 6 0 1 5 l V S3 3 3 0 5 1 ，p 0 0 5 ) 3 N e u r o t o x i ce f f e c t so fm i c r o g l i aa c c o r d i n gt ov a r y i n g
14、t i m ep e r i o d sa f t e r a c t i v a t i o no fm i c r o g l i av i aP A R 2 T h ep e r c e n t a g eo fe a r l y a p o p t o t i c a n dl a t e a p o p t o t i cc e l l sw a sd e t e r m i n e db y f u o r e s c e n c ea c t i v a t e dc e l l s o r t i n g ( F A C S ) T h r e ep o p u l a t i o n s o fn e u r o n sw e r e d i s t i n g u i s h e db
