《类固醇激素合成急性调节蛋白StAR在血管内皮细胞中的表达及对ABC蛋白表达的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《类固醇激素合成急性调节蛋白StAR在血管内皮细胞中的表达及对ABC蛋白表达的影响（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、类固醇激素合成急性调节蛋白( S t A R ) 在 血管内皮细胞中的表达及对A B C 蛋白表达的影响 宁艳霞马采杰江一峰陆超赵凤娣殷莲华陈思锋 复旦大学上海医学院生理与病理生理学幕，上海，2 0 0 0 3 2 关键词病理生理学 类目酵激素合成急性调节蛋白血管内麦细胞 一、刖昌 类固醇激寮合成急性调节蛋白( s t 钟o i d o g e n I ca c u t er e g u k t o r yp f o t e i n ，S t A R ) 首先是在类固醇激 素生成组织中发现的，对类弱醇激素合成具有重要限速作用订】S t A R 可介导褪澜醇由线越体外朕转 到线粒体内膜，之后胆圈
2、酵在线粒体内细胞色素氧化酶的作用下转化为极性璺强、曼易流出细胞的氧化 圈醇【l 】因此S t A R 有助于腮圃簿流出，可能参与了动脉粥样硬化中题固醇逆向转运过程 随着研究的深入。人们发现S t A R 除了存在于类巍醇激素生成维织外还表达予其他维织中其中 研究最多的是艇胶在肝细腿中，S t A R 同样具有将腿网醇由线粒体外貘转入内膜的作用，是胆汁酸性 合成途径的限速步骤驵) 更有意义的是在这个过獠中所产生的调节性氧化固酵( o x y s t e r 0 1 ) 其对维持 血浆胞固酵代谢平衡有熏要作用。可通过核内同醇类受体调节维持胆网静代谢平衡关键基因的表 达口一胡，以达到预防和治疗诸如动
3、辣粥祥硬化等与脂质代谢紊乱相关疾病的目的 朦质代谢紊乱是动脉粥样硬化发生的重要发病环节，而斑管内皮细胞剜是其发生发展的始动环节 维持胆圈醇代谢平衡尾预防动赫粥祥硬化发生的有效手段如果胆管内皮细胞可将过多的胆弱醇等脂 类物质由细胞内排出n 】，将可阻止过多的脂质进一步向内皮下沉积，进而阻止或减缀动脉粥样硬化的发 生和发展 我们前期的研究表明在大鼠心肌组织、小鼠脑，人主动脉和结缔组织等多种组织的血管内瘦细胞巾 均有S l A R 表达本研究旨在观察血管内皮细胞一b E n d 。3 细胞中S t A R 的表达及游离胆固醇( C H o ) 、 低密度脂蛋白( L D L ) 以及2 s 一羟化胆
4、固醇( 2 5 0 H ) 对菇的调节，弗避一步研究在内皮细胞中过表达 S t A R 之后对腿固醇逆向转运蛋白A B C A l 及A B C G l 表述的影响 二、材料与方法 ( 一) 实验仅器 倒置相差显微镜( L e i 忸) ，c o l 细胞孵悸箱( H e r “ u s ) ，R e l t l m e P C R 仪( B i o R 矗d ) ，稳流稳压电 泳仪( T a n o n ) ，凝胶图像处理系统( T a n o n ) 。M i I l i P r o l e a n 3C e l l ( B i o R 8 d ) 。M i l l iT m n s 一o
5、 t E l e c t r o p h o r e 6 cT m n s f e rC d l ( B i o R a d ) ( 二) 主要试赉j 小鼠脑血管内皮缨胞株一b E n d 3 ( 美国A T c c 收录) 胎牛血清( P A Al a b o r 鑫t o r i e s6 m C H ) t 2 3 P V D F 膜( P a l l G e l m a n ) ，胆圊醇。低密度脂蛋白。2 5 一羟化胆固酵( S i g m 8 ) ，T r i z o l ，S u p e f S c r i p tT M 逆转录试荆盒( I n v i t r o g e n )
6、，荧光探针( 5 F A M ，3 T A M A R ) 由英骏生物技术公司合成，兔抗大鼠 s t A R 多克隆抗体( A b c o m ) ，山羊抗人A B C A l 多克隆抗体，山羊抗人A B ( 羚1 多克隆抗体，兔抗山羊 H m 标记I g G 抗体，山羊抗兔H R P 标记I g G 抗体，山羊抗鼠H R p 标记1 9 G 抗体( S A N t A C R U z ) ，小 鼠抗G A P D H 单克隆抗体( 上海康成生物技术公司) 。A B C 一抗兔1 9 G 浓缩型试剂盒以及D A B 显色试 荆盒购自华美生物工程公司，其余试荆购自s i g m a 公司，其他鬻
7、用生化试剂为国产分析纯以上级筹唾 ( 三) 实验方鲁 1 b E n d - 3 夏愿代大鼠心肌徽血管内皮细胞豹培彝 b E n d 3 细胞培养条件，3 7 、5 c 0 I 、饱和温度培养箱f 用含l o F 鹬的D M E M 高糖培养液( 古 l o o U m 1 青霉素1 m g m l 链霉素) 。细胞长至镰满瓶底履甩含o 2 5 胰蛋白酶、o 0 3 E D 仃A 消化 液消化细胞并按1 O l o m 1 分瓶。2 3 天换液原代犬鼠心肌微血管内皮细胞的培养参见文献 1 】 2 免疫细胞化学染色方法【A B c 法l 参照A B C 试刺盒说明书进行。实验中用抗体稀释液作羽性
8、聪照，用D | A J 3 显色试剡盒显色抗体 稀释比铡为l l 2 0 0 3 含s 认R 全长c D N A 腺病毒载体的构建 含S t A R 全长c D N A 序列豹腺病毒载体( A d C M V S t A R ) 由美国弗古尾驱生物化学重点实验 窒任顺林博士惠蹭，能有效感染哺张细胞该病毒扩增纯化服务由北京本元正阳基因技术有限公司提 供，经H P L C 纯化及P C R 鉴定并从谈公司购买含增强黧绿色荧光蛋白空病毒载体( A d C M V E G F P ) 。 毛用含s 执R 全长由N A 的豫病毒感染b E n 也3 细胞 将b E n d 。3 细胞以6 1 0 5 或
9、4 1 0 0 每瓶接种于2 5 m I ( 提取R N A 用) 或7 5 m I ( 提取蛋自用) 培养瓶 中- 1 2 h 后彝培弊液分别加入O 5 或1 d 新鲜培养漩，以感染复数( m u I t i p l d t yo i n f e c t i ，M 0 1 ) 为 l O 的比例加人腺病毒词时设瞿石加腺瘸毒组及加入网等艨瘸毒空载体缝，效鬣细胞培养箱2 h ，其同每 隔1 5 m i n 轻轻摇匀培养渣，2 h 后，弃去古病毒的培养液，分别加入4 m l 或8 m l 新鲥培养液，置细胞培养 箱静置培养平感染4 8 h 后，按实骏衙要分剐提取细胞总R N A 或蛋良进行实验。
10、5 R l 一m eR T P C R 采用p r i m 盯3 O 软件设计副镌及荧光探针荧光探针5 ，束端标记荧光报告基团F A M ( 6 一r b o x y - f l u o r e s c d n ) - 3 京端标记荧光淬灭基剐T A M R A ( 6 一c a 曲o x y t e t f a m e t h y l r h o d a n 疽n e ) 其引物及探针 序列如下， S t A R 上游引物I5 ，一T T G G G C A T A C T C A A C A A C C A G 一3 ； 下游引物l 亨一G A C A T T T G G G T T C
11、C A C T C T C C 一譬I 产物长度1 9 5 b p ，S t A R 荧光探针弓l 物l 亨一C C T C C A T G C G G T C C A C A A G T T C T T C 一了I G A P D H 上游引锈；宁一C C A T T T G C A G T G G C A A A A G 一了， 下游弓I 物：5 一C A C C C C A T T T G A T G T T A G T G 一3 I 产物长度2 0 1 b p ，G A P D H 荧光探针引物：5 一C A A G G C C G A G A A T G G G A A G C T
12、T G T C 一了l A B C A l 上游引物t F T G G r r T G T T A G C A G C C T C A T C 一亨 下擗等I 物t5 一A G C A c T G T A G G A T G G T C A C C 一3 7 l 产物长度1 4 8 b p 。A B C A l 荧光探针弓I 物1 5 一A C A G A C A G G A A 6 A C G A A C A C C A c G C T 一3 l A B C G l 上游引物1 5 。一G T A C C A T G A C A T C G C T G G T G 一亨I 下游引物l5 一A
13、 G C C G T A G A T G G A C A G G A T G y i 2 4 产物长度2 2 5 b p ( 其中小鼠A B C G l 基因捡i 赋采用S Y B g r n 染辩法) P C R 反成体系及条件根据 厂商说明书进行R e 8 l t i m eP C R 数据分析参照文敝进行 I 】 6 W 嚣扯r nB I o t 将b E n d 。3 不问处理后按常规方法抽提总蛋白，用B C A 法测定番白质浓度，w e s t e r n B l o t 实验步 骤参照分子克隆宴验指南进行 7 统计学处理 数据以均数士标准夔( i 士8 ) 表示i 组闷差异羽苇因素
14、方差分析所有统计分析用S P S S1 1 5 软件 完成。p O 0 5 为差异有意义 三、结果 ( 一) 免疫细胞化学显示s t A R 在血管内皮细胞中表选 用免痰细胞化学的方法显示狂b E n d 3 细胞、原代培养构大鼠心肌微呶管内皮细胞( R M M V E C ) 中 均有S t A R 的表达，而且主要存在于细胞浆中( 图1 ) 。 图1 用免疫化学方法显示S t A R 在不同内皮纲胞中的染色 凡b E n 止3 曲I l 中S t A R 曼色，K 愿代培舞的太鼠心肌徽血瞥内皮细胞中s I A R 的置色 ( 二) R e a l t i m eP C R 撩测C H O
15、、L D L 以及2 5 一O H 对b E n d 。3s t A Rm R N A 袁迭的 影响 1 R e 埘一t 妇eR T P C R 检演C H o 对b E 嘲3S t A Rm R N A 表达的影响 结果摄示，C H O 对b E n d 3S t A Rm R N A 表达的影响存在明最的时问和剂量依赖性t C H o ( 1 0 鹏 m 1 ) 作用b E n 也32 h 后S A Rm R N A 即表达增强。在4 h 达到高峰，可持续增高约2 0 h ，随后减弱，如图 2 一A 所示；不弼浓度C H 0 ( 0 2 0 弘g m 1 ) 作用b E n d 34 h
16、君S t A Rm R N A 袭达强度随浓度的增大瓶 增强，如图2 一B 所示，C H o 在l 弘g d 时即可增强S t A Rm R N A 的表达。在1 0 p g m l 时作用最强 2 R 髓卜- t i m eR T P C R 检澜L D L 对b E d 3 s 瞧R m 鼗N A 表达的影响 结果显示，L D L 对b E n d 3S t A Rm R N A 表达的影响存在明显的时间和剂璧依赣性，L D L ( 1 5 心 m I ) 作用b E n d 32 h 后s t A R m R N A 即表达增强。在4 h 达到商峰可持续增高约2 0 h ，随后逐渐减弱如 躅3 一A 所示I 不问浓度L D L ( o 一2 0 “g m 1 ) 作用b E n d 34 h
