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1、新课导入,下面请看一条新闻,艾滋病研究进展 英国自然杂志登论文说，“”蛋白质可有效抑制艾滋病病毒的感染。 此后，世界各地的很多科学家开始研究“”蛋白质的结构，但到目前为止尚未有人宣称取得突破性进展。,提问,研究“TRIM5”蛋白质的第一步是什么？,分离和提纯TRIM5蛋白质。,回答,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质、对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。,如何分离和提纯蛋白质？,课题3 血红蛋白的提取和分离,专题五 DNA和蛋白质技术,教学目标,知识目标,1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。 2.掌握蛋白质提取的基本
2、概念。,能力目标,1.学习对血液中蛋白质提取和分离的方法。 2.掌握从复杂提取中提取生物大分子的基本过程和方法。,过程与方法,情感态度与价值观,本实验采取实验与课本相结合的方法，在实验中掌握分离大分子物质的基本方法。,1.发挥学生主观能动性。 2.激发学生学习兴趣，培养学会僧创新能力。,教学重难点,课题重点,凝胶色谱法的原理和方法。,课题难点,1.样品的预处理。 2.色谱柱填料的处理。 3.色谱柱的装填。,内容解析,概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,缓冲溶液,基础知识,思考：说出说出几种常见的
3、缓冲对,NaH2PO4 /Na2HPO4,H2CO3/NaHCO3,缓冲溶液由共轭酸碱对组成。这一共轭酸碱通常称为缓冲对、缓冲剂或缓冲系。常见的缓冲对主要有三种类型。,弱酸及其对应的盐：,弱碱及其对应的盐：,多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐:,H2CO3NaHCO3 ；CH3COOHCH3COONa,NH3H2ONH4CL ; NH4OHNH4CL,NaHCO3Na2CO3 ；NaH2PO4Na2HPO4,缓冲溶液通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。 调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。,缓冲溶液的配制,利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便
4、于观察和科学研究。,凝胶色谱法,什么是凝胶？,凝胶是一些多糖类构成的内含许多贯穿的通道的微小多孔的球体。,凝胶色谱法的原理,相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，在凝胶的外部移动，路程较长，移动速度较慢。,相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。,电泳,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,琼脂糖凝胶电泳,概念,分类,聚丙稀酰胺凝胶电泳,视频：,电泳的原理,试验设计,动物血液,缓冲溶液,凝胶色谱柱,电泳装置,离心机,化学试剂,1.样品处理,血液的组成,1.1 红细胞的洗涤： 离心将血液分层 用胶头吸管吸出黄色血浆 用生理盐水洗涤。,洗涤
5、前,洗涤后,1.3 分离血红蛋白溶液： 离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。,1.2 血红蛋白的释放： 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放。,1.4 透析： 装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。,2.凝胶色谱操作,2.1 凝胶色谱柱的制作,取胶皮盖,打孔,安装玻璃管,安装尼龙网,安装100目尼龙纱,组装,完成！,2.2 凝胶色谱柱的装填,材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）,A、固定：将色谱柱装置固定在支架上,B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内,装填方法：,C、洗涤平衡：装填完毕后，用磷酸缓冲液缓冲液充分洗涤平衡12小时,2.3 样品的加样和洗脱
6、,A、调节缓冲液面 B、滴加透析样品 C、样品渗入凝胶床 D、洗脱,E、收集 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。,实验结果,1.样品的处理,血液离心后分层,实验结果与分析,成功！,1.洗涤次数过少，未能除去血浆蛋白。,2.离心速度过高和时间过长，白细胞和淋巴细胞一同沉淀。,失败原因：,2.凝胶色谱柱装填,加入有色物质，观察色带移动情况。,方法：,血红蛋白色带狭窄、均匀、平整,血红蛋白色带歪曲、散乱、变宽,相关链接,为什么有的血管是蓝色的？,携氧的血是鲜红色的，当你被划伤时，你看到的是鲜红的携氧血。,不携氧的血是深紫色的，当你献血时，血被抽到没有氧气
7、的试管里，你看到的血是深紫色的。,深紫色的无氧血流经我们的静脉时却呈蓝色,为什么,不同的光线透过皮肤的方式不同：蓝光在皮肤表面被反射回来；红光透射得比较深；静脉中深色的血吸收大部分红光。所以我们看到的是皮肤表面反射的蓝光 。,另外一些生物，如蛇类和蟹类，用铜来运输氧气，所以他们有真正的蓝血。,课堂小结,缓冲溶液：,在一定的范围内，能够抵制外加少量强酸或强碱，使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。,凝胶色谱法：,根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离的方法。,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,电泳：,实验过程,1.样品处理,红细胞的洗涤,血红蛋
8、白的释放,分离血红蛋白溶液,透析,2.凝胶色谱操作,凝胶色谱柱的制作,凝胶色谱柱的装填,样品的加入和洗脱,3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,高考链接,1.2009.山东 细胞分化是奢侈基因选择性表达的结果。下列属于奢侈基因的是（ ） A.血红蛋白基因 B.ATP合成酶基因 C.DNA解旋酶基因 D.核糖体蛋白基因,A,解析： 题干中给予“细胞分化是奢侈基因选择性表达的结果”，根据题干可知，找出分化的细胞中特殊成分的基因即可，四个选项中BCD是所有活细胞中都具体的基因，而A.血红蛋白基因是分化后的红细胞才表达的基因。,2.2003全国卷理综 能与人体血液中血红蛋白结合的一种有毒气体是( ) A.氯气
9、 B.氮气 C.一氧化碳 D.甲烷,C,解析： CO与血红蛋白结合，造成CO中毒，即煤气中毒。,课堂练习,填空题,1.样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是（ ）-（ ）-（ ）-（ )。,有机溶剂,脂类物质,红细胞破碎物沉淀,血红蛋白溶液,2.一分子血红蛋白最多可携带( ) O2分子数和（ ）CO2分子数。,个,个,选择题,1. 随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是（ ） A. 弄清各种蛋白质的空间结构 B. 弄清各种蛋白质的功能 C. 弄清各种蛋白质的合成过程 D. 获得高纯度的蛋白质,2. 用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，
10、正确的是（ ） A. 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质 B. 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质 C. 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质 D. 二者根本无法比较,A,简答题,1.人们用鸡的红细胞提取DNA，用人(猪、牛、羊）的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,答： 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,2. 蛋白质的分离和提取的原理是什么？,答： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分
11、子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。,3. 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？,答： 两者都利用了蛋白质的变性作用，破坏了其空间结构。,教材习题答案,1.凝胶色谱法分离蛋白质的原理是怎样的？,答：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。 所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。,相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路
12、程较短，移动速度较快； 相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。 因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。,此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。,2.什么是缓冲溶液？它的作用是什么？,答： 在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫缓冲作用。,缓冲溶液的作用是维
13、持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH 下进行的受到氢离子浓度的严格调控。 为了在实验室条件下精确的模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的PH。,具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得的，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。,3.电泳及其原理是什么？,答：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电； 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相
14、反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。,4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,答：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理； 再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离； 然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化； 最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。,5. 与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？,答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,再见,
