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1、体内稳定表达HER2多表位基因B16细胞系的建立 作者：李贺, 向泽敏, 吴秀丽, 王莉, 卫红飞, 万敏, 王丽颖, 于永利【摘要】 目的: 建立体内稳定表达HER2多表位基因的小鼠黑色素瘤B16细胞系。方法: 利用分子克隆技术构建真核表达载体pcDNA3GFPHER2, 阳离子脂质体介导法将其稳定转染入B16细胞, G418克隆筛选及体内传代后, 流式细胞术(FCM)分选出GFPHER2表达阳性细胞群, 对该群细胞进行无G418条件下的单克隆筛选并进行体内稳定性检测。结果: 经限制性内切酶鉴定及序列分析, pcDNA3GFPHER2构建正确; 最终建立的表达HER2基因B16细胞系体内传代
2、后GFPHER2阳性率高于90%。结论: 成功建立了体内稳定表达HER2多表位基因的小鼠黑色素瘤细胞系, 为其他体内稳定表达外源基因的转染细胞的建立提供了借鉴。 【关键词】 小鼠黑色素瘤细胞; HER2; 阳离子脂质体Abstract AIM: To establish a B16 cell line stably expressing genes encoding HER2 multiepitope peptides in vivo. METHODS: Eukaryotic expressing vector pcDNA3GFPHER2 was constructed by molecula
3、r cloning technique and transfected into B16 cells mediated by cationic liposome. After screened with G418, the transfected cells were passaged in vivo. The GFPHER2 positive cells were isolated from tumor burdening mice by flow cytometry (FCM) sorting, and then monoclonized in the absence of G418 to
4、 obtain a B16 cell line stably expressing genes encoding HER2 multiepitope peptides in vivo. This cell line was then identified after being passaged in vivo. RESULTS: Restriction endonulease analysis and DNA sequencing showed that the pcDNA3GFPHER2 was constructed and a B16 cell line stably expressi
5、ng genes encoding HER2 multiepitope peptides in vivo was obtained successfully. The GFPHER2 positive proportion maintained higher than 90% after being passaged in vivo. CONCLUSION: A B16 cell line stably expressing genes encoding HER2 multiepitope peptides is established successfully, which would pr
6、ovide a method to establish other cell lines stably expressing exogenous genes.KeywordsB16 cell; HER2; cationic liposome基因转染技术是生物学研究的重要手段1, 2, 目前用于基因转染的载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。阳离子脂质体转染法属于非病毒载体介导的基因转染方法, 由于其具有操作方法简单、 可携带大片段DNA、 试剂商品化和毒性低、 安全和无免疫原性等优点, 而逐渐替代病毒载体并为广大研究者所接受。但阳离子转染法转染的细胞在体内存在稳定性差的缺点3, 4, 这也一直
7、是困扰大家的的难题。为了解决阳离子脂质体介导的基因转染细胞的体内稳定性问题, 本研究以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）为报告基因, 将阳离子脂质体转染法及小鼠体内细胞传代、 流式细胞术(FCM)分选、 无G418条件下的体外筛选等技术相结合, 建立了小鼠体内稳定表达HER2多表位基因的小鼠黑色素瘤细胞系（B16）, 该实验体系的建立为其他体内稳定表达外源基因的转染细胞的制备提供了很有价值的参考。1 材料和方法1.1 材料 健康清洁级C57BL/6J小鼠(雌性, 68 周龄), 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。Lipofectin、 TRIzol
8、试剂购自Invitrogen公司。pMD18THER2载体（含HER2多表位基因)、 pcDNA3GFP载体、 C57BL/6J小鼠来源的黑色素瘤细胞株B16由吉林大学白求恩医学院分子生物学实验室提供。G418、 IMDM干粉购自Gibco公司。标准胎牛血清（FBS）购自天冿TBD公司。限制性内切酶、 T4连接酶和DNA marker购自TaKaRa公司。1.2 方法1.2.1 pcDNA3GFPHER2载体的构建 应用Hind III和BamH I分别酶切pMD18THER2和pcDNA3GFP载体, 经琼脂糖凝胶回收, 将载体和目的片段进行连接, 连接产物转化E.coli JM109。挑选
9、转化平板上的单菌落接种于5 mL LB培养基, 过夜培养, 以碱裂解法提取质粒。重组质粒经Hind III和BamH I双酶切鉴定并进行测序分析。鉴定正确的重组质粒用于细胞转染。1.2.2 细胞转染及鉴定 参照说明书应用阳离子脂质体Lipofectin将pcDNA3GFPHER2转染入小鼠黑色素瘤细胞系, 转染后的细胞用含200 mL/L FBS IMDM（IMDM完全培养液）稀释, 按每孔0.2个细胞/100 L铺96孔平底培养板, 37、 5 mL/L CO2孵箱中培养。次日, 每孔补加100 L含1 600 mg/L G418的IMDM完全培养液, 1 周后用含800 mg/L G418
10、的IMDM完全培养液换液。2 周后在共聚焦荧光显微镜下观察, 选择细胞状态好、 荧光强、 呈单集落生长的细胞进行扩增, 即获得GFPHER2表达阳性的B16细胞。将上述细胞经过液氮冻存、 37水浴复苏和连续传代培养2 周后, 用共聚焦荧光显微镜和FCM在蛋白水平上检测GFPHER2的表达。参照TRIzol试剂说明书提取转染细胞的总RNA, 逆转录后进行PCR反应, 检测HER2基因mRNA的表达（上游引物: 5CTGCAGGATCCATGGACGAAGCATACGTTATGGC3; 下游引物: 5GCGGCCGCAAGCTTAAGATCTACCTTGCAGAGTCAGAGAGTAA3）。1.2
11、.3 体内稳定表达HER2多表位基因B16细胞系的建立及鉴定 将3105个细胞（G418 800 mg/L环境中培养）重悬于0.2 mL IMDM中, 皮下接种于C57BL/6J小鼠右侧后腿躯干处。待肿瘤大小约为1 cm1 cm时, 进行无菌剖离, 研磨。将细胞悬液置于IMDM完全培养液中, 37、 50 mL/L CO2孵箱中培养。次日, 更换IMDM完全培养液, 继续培养贴壁细胞, 1 周后即得到经体内传代后的pcDNA3GFPHER2转染的B16细胞。应用流式细胞仪（BD FACS Aria Cell Sorter）检测该群细胞中GFPHER2表达情况, 并分选出GFPHER2表达阳性的
12、细胞。 将GFPHER2表达阳性的B16细胞用IMDM完全培养液稀释, 按每孔0.2个细胞/200 L的比例, 铺96孔平底培养板, 37、 50 mL/L CO2孵箱中培养。2 周后应用FCM和共聚焦荧光显微镜观察各细胞克隆的GFP表达情况, 选择细胞状态好、 荧光强、 GFPHER2表达率高、 呈单集落生长的细胞进行扩增, 得到体内稳定表达HER2基因的B16细胞系。将上述方法得到的B16转染细胞进行体内传代（方法同前, 接种前在不含G418环境中培养）, 记录肿瘤发生时间并通过共聚焦荧光显微镜及FCM检测GFPHER2表达情况。2 结果2.1 pcDNA3GFPHER2载体的构建 pcD
13、NA3GFPHER2载体经Hind III及BamH I酶切后, 8 g/L琼脂糖凝胶电泳显示1 054 bp基因片段（图1）; 序列分析结果表明, 质粒pcDNA3内插入片段的碱基顺序完全正确, 表明pcDNA3GFPHER2重组质粒构建成功。2.2 转染pcDNA3GFPHER2的B16细胞鉴定 阳离子脂质体转染法将pcDNA3GFPHER2重组质粒转染B16细胞, 通过G418压力筛选及有限稀释法进行筛选和克隆化, 得到1株转染pcDNA3GFPHER2的B16细胞, 命名为B16/HER21。经RTPCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定, 得到344 bp的HER2特异性条带（图2A）。共聚焦荧光
14、显微镜检测发现, 该细胞发出较强的绿色荧光（图2B）; FCM检测结果显示, 转染效率达到73.53%（图2C）, 提示在成功建立了pcDNA3GFPHER2转染B16细胞系, 该细胞在G418存在的情况下比较稳定。图1 pcDNA3GFPHER2重组质粒的鉴定（略）Fig 1 Identification of recombinant pcDNA3GFPHER2 plasmid1: DNA marker; 2: Recombinant pcDNA3GFPHER2 plasmid digested with Hind III and BamH I.图2 转染pcDNA3GFPHER2的B16细
15、胞（B16/HER21）的鉴定（略）Fig 2 Identification of B16 cells transfected with pcDNA3GFPHER2 (B16/HER21)A: RTPCR of HER2 gene. 1: DNA marker; 2: B16/HER21; 3: B 16 cells.B: Confocal microscopy of B16/HER21 (100).C: FACS analysis of B16/HER21.为了获得体内稳定表达HER2多表位基因的B16细胞系, 我们将B16/HER21接种到小鼠皮下, 检测体内传代后GFPHER2表达的情况, 结果显示, 体内传代后该转染细胞GFPHER2表达率为22.50%（图3A）, 仅为体内传代前的30.56%, 提示该转染细胞在体内稳定性较差。依据GFP的绿色荧光指示, 应用FCM分选出该细胞中GFPHER2表达阳性的细胞, 再在无G418的环境中进行单克隆化, 最终得到1株生长状态好, 绿色荧光强度高的细胞。该细胞GFPHER2表达的阳性率可达94.32（图3B）, 命名为B16/HER22。为了观察B16/HER22的体内稳定性, 我们再次将该细胞株进行了体内传代, 在肿瘤接种后15 d内出瘤率达到100%（图4A）
