空间环境对B16细胞侵袭和转移影响的体内外实验研究

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1、空间环境对B 1 6 细胞侵袭和转移影响的体内外实验研究 柴大敏1向青2陆国玉1武世伍1徐梅2 徐波2 耿传营2 房青2 李红艳2陈志华2陶仪声1唐劲天3 1 蚌埠医学院病理教研室，安徽蚌埠，2 3 3 0 0 3 2 中日友好医院临床研究所，北京，1 0 0 0 2 9 3 清华大学，北京，1 0 0 0 8 4 关键词空闯科学B 1 6 细胞谤变侵袭转移 一、引言 空间环境是指距离地球表面1 0 0 k m 以外的大气空阃。是完全不同于地球表面的特殊环境，存在馓 重力、电离辐射、亚磁场，高囊空、超净环境以及航天器中的馓环境等，其中主要影响因素是馓重力和电 离辐射众多国内外文献报道。搭载于空

2、间飞行器中的微生物、植物种子、植物体、体外培养的细胞和动 物均会产生各种各样的变化 1 - ”而无源搭载肿爝细胞诱变的实验从2 0 0 2 年底“神舟四号”开始，至今 已成功搭载3 次，获得了大量的太空诱变单克隆细胞株啪本次实验从搭载于“第2 0 颗返回式卫星”的 B 1 6 细胞返地后单克隆化的1 1 0 株细胞中随机选取1 5 株作为实验对象。通过体内外筛选实验，期望筛 选出免疫原性有所变异的细胞株 二、材料和方法 ( 一) 实验材料 1 肿瘤细胞株 野生型B 1 6 细胞株购自中国科学院上海细胞库 实验组B 1 6 细胞株搭载于。第2 0 颗返回式卫星” 空间飞行1 8 天后，回收、单免

3、隆化、从获取的1 1 0 株空间诱变B 1 6 细胞，随机选取1 5 株顺延编号2 8 4 4 I 地面对照B 1 6 细胞株培养于。细胞低温长期生存系统”中培养条件和实验组相同。 厶小鼠和动物模型的建立 C 5 7 B L 6 J 近交系小鼠清洁级雄性8 周龄体重1 8 2 0 9 。中国医学科学院实验动物研究所提 供许可证编号：S C x K 京2 0 0 4 0 0 0 1 将其随机分为2 组尾静脉接种组、腹腔接种组。每组l O 只每只小鼠分别注射0 2 m l 古5 1 0 5 个实验组或对照组的细胞悬液。 ( 二) 实验方法 1 侵袭实验 设3 个复室；在T r a n s w e

4、l l 小室( C o r n i n g 公司) 外表呵涂趋化剂F N ( 北京大学医学院生物细胞系) 5 f | g ，充分涂匀，内表面涂M a t r i g e I ( B D 公司) 5 弘g ；胰酶消化计数，取2 1 0 5 个细胞悬液置于小室中I 4 4 3 7 、5 C O ：温箱孵育4 h ；吸弃培养纂棉签充分擦净膜内表筒未穿过的细胞；将内室置于4 的甲醛 溶液同定o 5 h H E 染内室；在4 0 0 倍显微镜( o I y m p u s I X 5 1 ) 下分别计数上、中，下、左、右五个视野的 细胞数计算空间环境对肿瘤细胞侵袭的抑制率t 抑制率= 塑坚驾麓辇麓勰碧必

5、 2 划痕标记染科示踪技术实验 按照参考文献( 4 的方法改良接种1 0 F J ：i S 的D M E M 混息B 1 6 细胞1 0 个于3 5 彻平皿内l 3 7 。5 的C 0 l 孵箱内培养过夜，使单层细胞达饱和密度l 吸弃培养基用锐刀划痕后，加入0 0 5 罗 氏黄( P B S 配制，S i g m a 公司) 1 2 m I ；继续孵育3 m i n 。吸弃染料P B S 洗3 次，加入1 0 F B S 的D M E M ； 倒霞相差荧光显徽( 0 l y p u sl X 7 1 ) 下观察荧光染科传递荧光染料只限于划痕细胞边缘单列细胞为阴 性，向邻近传递2 3 列或3 列

6、以上则为阳性 3 观察细胞株成瘤、生存期及转移情况 尾静脉接种组：接种2 0 天后，乙醚麻醉摘眼球取血颈椎脱臼法处死小鼠取肺称重。固定于 B o u i n s 液内z 4 小时后在解剖显微镜( 1 0 ) 下计敬肿瘤灶散。同定于7 0 酒精内，石蜡包埋，每例标 本均4 “m 厚。计算肺转移抑制率 抑辔率一( 对照组肺转移瘸灶敷一实验组肺转移瘤灶数) 对照组肺转移瘸灶数 腹腔接种组t 观察并记录生存朗 4 统计分析 数据采用S P S S l 3 O 软件包单因素方差分析q 检验进行比较；免疫组化结果采用统计学等级相关 检验( 秩和检验) 处理。 三、结果 1 空间环境对B 1 6 细胞侵袭能

7、力的影响 空间环境对3 3 B 1 6 黑色索瘤细胞的侵袭和运动能力均有显著的抑制( 见表1 ) 囊l空甸环境对B 1 6 蛔胞侵袭重蛆基雇脯能力的影响 暑l s # 与野生受比较P O 0 5 2 划痕标记染科示技术检测细胞间通讯功能 如下图所示，经过空间诱变以后有的细胞株细胞问隙通讯功能增强染料传输的细胞列数增多( 见 图1 、图2 ) 4 5 圈14 4 细胞染料传输l 2 列绷胞( 十+ + )图2 野生摄B 1 6 细胞染科传输1 列细胞( 一) 3 尾静脉接种组 经过空阃诱变后各株细胞的肺重量和肺转移瘸个数明显减少、抑瘤j 孛；明显增强。S P S S l 3 o 软件 包分斩，q

8、 检验P O 0 5 有统计学意义( 见袁2 ) 寰2 空阀环境对肺转移形成的影响 往l 与野生曩相比较，弱I 土1 6 蝈照P ( 0 0 5 o P O 0 1 文腹腔接种组 空间飞行后。实验组在岛7 B L 6 J 小鼠体内的带瘸生存期明显延长有统计学意义( P o 0 5 ) 结 果如下( 见圈3 ) t 4 6 捌3荷癌小鼠生存期单因素方差分析( 口检验) P O 0 5 s 免疫组化 以胞浆中存在棕黄色或褐色颗粒有无作为结果判断依据。根据染色有无分为阳性翔阴性。阳性细 舱 6 0 为强阳性( + + + ) 按四点积分法l O ：阴性I l ：+ l2 l + + 1 3 + +

9、+ ( 见图4 、图5 和表3 、表4 ) 图4V E G F 在最色寮窟中的表达( z 0 0 ) 图5n m 2 3 在黑色素腐中的表达( z O O ) 囊3 、r l 粥F 在转移中的寰达 H c = 2 2 s 6 8 9 秩和检验螭朱，空阿诱变B 1 6 菩蛆与野生型相比较睬3 7 0 外均具有筑计学意义( P o 0 5 ) 四、讨论 空间环境不同于人类赖以生存的地球环境空间生物学研究表明，傲蓖力可以引起生物细胞生理功 能显著变化，离子辐射改变生物细胞生长特性空问复合作用更加易于诱发细胞变异o 】本课题组应用 4 7 空间综合因素结合分子生物化学的方法研究空间环境对恶性黑色素瘤B

10、 1 6 的侵袭和转移的影响而 体外研究侵袭和转移的较好的模型就是人工重建基底膜课题组成员采用T r a n s w e U 小室模拟肿瘤细 胞体内侵袭血管基底膜的过程从5 株细胞株中筛选出3 3 # 侵袭能力均较对照组显著降低( P o 0 5 ) 提示空间环境可能会影响肿瘤细胞的侵袭牯附能力 同时作者从肿斓细胞问隙连结通讯( C U l C ) 功能方面着手进行筛选，目前诱导提高肿瘤细胞间隙连 结通讯( G J I C ) 功能已经成为肿瘤治疗研究的新方向细胞间隙连接通道是上皮细胞之问能够直接进 行小分子( 相对分子质量小于l 0 0 0 道尔顿) 物质交换的通道G 儿C 功能被认为在控制

11、细胞生长和保持 细胞数量稳态方面具有重要的作用 I 】从选取的5 株细胞中筛选出一株G J I C 功能增强的4 4 + 空问诱 变B 1 6 说明空间环境可能从改变肿瘤细胞问的G J I C 而影响肿瘤的侵袭和转移 V E G F 是一种相对分子质量4 0 0 0 0 4 5 0 0 0 的分泌性糖蛋白。其前体R N A 包含8 个外显子和7 个内含子它能特异作用于内皮细胞，引起m 管内皮细胞增殖并在体内诱导血管生成其生物学功能 主要是通过与其受体结合而诱导血管内皮细胞增殖促进内皮细胞的迁移，侵入胶原中形成臂状结构啪 以及增加馓血管特别是毛细血管后静脉和小静脉的通透性为血臂形成前的肿瘸营养以

12、及后来的肿措 细胞逸出血管提供了条件恶性黑色素瘤主要通过血道转移而肿瓣血管生成对淋巴结转移有间接的 促进作用叫课题组成员通过检测转移瘤组织中V E G F 蛋白的表达，发现空间实验组V E G F 的表达显 著降低( P O 0 5 ) ，尤其是2 8 细胞株而眦1 1 2 3 的表达与肿瘤的转移能力戚反比，即彻【1 2 3 在低转移 瘤细胞中的表达较高于高转移瘤细胞中的表达 将m 2 3 一H l c D N A 导人黑色素瘤。可以显著降低 其转移能力在本实验研究发现t 实验组瘤体n m 2 3 的阳性表达明显高于对照组，在皮下成瘤检测有统 计学意义。蚴2 3 在肺转移瘤中的阳性表达同样是实

13、验组高于对照组。这与张秀英等 1 妇研究结果相一 致。至于V E G F 与n m 2 3 在瘤体中的表达有无协同作用，还有待进一步研究 综上所述，空间复合因索通过蛋白和整体的水平影响恶性黑色索瘤B 1 6 的侵袭和转移能力，增加 肿擒细胞问的通讯功能而I L 一2 在空间环境对小鼠黑色素瘸细胞株侵袭和转移的影响作用仍需进一 步探讨 五、结论 ( 1 ) 空间环境可影响恶性黑色素瘤B 1 6 侵袭能力和细胞间通讯功能I ( 2 ) 空阃环境对小鼠黑色素瘤细胞株转移瘤形成有一定的抑制作用； ( 3 ) 空阃环境降低V E G F 在小鼠黑色素瘤细胞株中的表达同时增加n m 2 3 的表达但V E

14、 G F 与 n m 2 3 的表达是否有协同作用尚待进一步研究 ( 4 ) 空阃环境对小鼠黑色索瘤细胞摊转移瘤形成的抑制是否通过分秘l L 一2 来发挥作用，还有待于 近步研究 参考文献 1E 皿o I e n k oZ M M a r t o v e t s k a i aV A C h u g u n o vV A ，e ta 1 E f f e c to fs p a c en i g h tc o n d i t i o n so n p r o p e r t ；e so fh y d r o c a r b o n o 妇d i z i n gb a c t e r i a P

15、r i k IB i o k h i mM i k r o b i o I 2 0 0 0 3 61 6 4 7 6 5 l 2R o u xS J ，C h a t t e f j e eA ，H i l l i e rS e ta 1 E a “yd e v e l o p m e n to ff e mg a m e t o p h y e si nm i c r o g M v i - t y A d vS p a c eR e s ，2 0 0 3 3 lI2 1 5 2 2 0 3 詹劲天，向青，徐梅等空间谤变肿瘤蛔胞的初步研完中固康复理论与卖践，2 0 0 4 ，1 0 1 6

16、4 l 6 4 3 4M o h a m e dH ，F o u l yE L ，J a m e sE S c r 8 p e 2 l o a d i n ga n dd y et r a n s f e rl ar a pi da n ds i m p l et e c h n i q u e t os t u d yg a pj u n c t i o ni n t e r 睫I I u l a r m m u n i c 且t i o n E x pC e l lR e s ，1 9 8 7 ，1 6 8 I4 2 2 4 3 0 5B a k o sA tV a r k o n y iA ，