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1、 博士学位论文 空肠弯曲菌血红素氧合酶 ChuZ 的结构解析与 功能研究 张 睿 张 睿 指导教师 邹全明 教授 第三军医大学医学检验系临床微生物与免疫学教研室，400038 申请学位级别 博士科学学位 专业名称临床检验诊断学 论文提交日期 2011 年 10 月 论文答辩日期2011 年 11 月 学位授予单位和日期 第三军医大学 2011 年 月 答 辩 委 员 会 主 席 评 阅 人 二 一 一 年 十 一 月 分类号分类号 密密 级级 公公 开开 学学 号号 2007163 第三军医大学研究生学位论文独创性声明 秉承学校严谨的校风和科研作风，本人申明所呈交的论文是我本人在 导师指导下进
2、行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别 加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究 成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料， 与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 日期： 第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解第三军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军医大学。学校有 权保留并向国家有
3、关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外） ，可 以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 目 录 英文缩写一览表 1 英文摘要 3 中文摘要 6 论文正文 空肠弯曲菌血红素氧合酶 ChuZ 的结构解析与功能研究. 9 前 言.9 实验材料.12 实验方法.15 实验结果.32 讨 论.58 小 结.68 致 谢.69 参考文献.71 文献综述 血红素氧合酶研究进展76 参考文献.87 博士期间发表的文章 .95 第三军医大学博士学位论文 1 英文缩写一览表 缩写 英文全称 中文全称 A
4、ngstrom (1 = 1.0 10- 10 meters) 埃 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 bp Base pair 碱基对 BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 C.jejuni Campylobacter jejuni 空肠弯曲菌 d Day 天 Da Dalton 道尔顿 ddH2O Double distilled water 双蒸水 DMSO dimethyl sulfoxide 二甲亚枫 DNA Deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 E.coli Escherichia coli 大肠杆菌 EB Ethidium br
5、omide 溴化乙锭 EP Eppendorf 微量离心管 G Gram 克 H Hour 小时 H. influenzae Hemophilies influenza 流感嗜血杆菌 HO Heme Oxygenase 血红素氧合酶 IPTG Isopropyl- 1- thio- - D- galactoside 异丙基硫代- - D 半乳糖苷 ITC Isothermal Titration Calorimetry 等温滴定量热法 Kan Kanamycin 卡那霉素 kD Kilodalton 千道尔顿 L Liter 升 LB Luria- Bertanin broth LB 培养基
6、Mw Moecular weight 分子量 mg Milligram 毫克 min Minute 分 ml Mililiter 毫升 第三军医大学博士学位论文 2 MR Molecular Replacement 分子置换 NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate 还原型烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸磷酸 OD Optical density 吸光度 PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 PDB Prote
7、in Data Bank 蛋白结构数据库 PEG Polyethylene glycol 聚乙二醇 R free Free R factor 晶体学自由 R 因子 R- factor R- factor 晶体学 R 因子 rpm Revolution per minute 转分 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 SSRF Shanghai Synchrotron Radiation Facility 上海同步辐射光源 TAE Tris/acetate/(buffer) Tris/乙酸电泳缓冲液 TE Tris/EDTA buffer Tris- EDTA 缓
8、冲液 TEMED N,N,N ,N - tetramethylethylene diamine 四甲基乙二胺 Tris 2- amino- 2- hydroxymethyl- 1.3- pr opanediol 三羟甲基氨基甲烷 U Unit 单位 Wavelength 波长 l Microliter 微升 第三军医大学博士学位论文 3 Crystallographic and functional studies on ChuZ, a heme oxygenase from Campylobacter jejuni Abstract The gram- negative, micro- ae
9、rophilic bacterium Campylobacter jejuni (C. jejuni), is detected in the gut of a wide range of food- supply animals and avian species. It is a major cause of acute gastroenteritis in industrialized countries. C. jejuni infection is also implicated in the development of serious immune- mediated neuro
10、logical conditions known as Guillain- Barr and Miller- Fischer syndromes. Iron acquisition is essential for survival, persistence, and pathogenicity of the bacterial because free iron is maintained at very low levels by the hosts, partly in order to restrict microbe growth. As a result of iron short
11、age, C. jejuni tend to use heme as the sole iron source. With the continual emergence of resistant strains, new methods to prevent and control the infection of C. jejuni are urgently needed. The heme oxygenase ChuZ is part of the heme utilization mechanism of C. jejuni, and may serve as a promising
12、candidate for development of novel anti- bacterial drugs, thus we have embarked on structure determination and function analysis of ChuZ from C. jejuni. Methods 1. Cloning, expression and purification of ChuZ. The chuZ gene was amplifi ed from the genome of C. jejuni NCTC11168 and cloned into an exp
13、ression vector derived from the pET22b plasmid and placed between NdeI and XhoI restriction sites, The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) competent cells and the protein was expressed under the induction of IPTG and then purified by affinity, gel- filtration and ion
14、 exchange chromatography. 2. Crystallization of ChuZ- hemin complex Hemin solution was slowly added to purified ChuZ, The solution was incubated at overnight and the extra hemin was removed by gel filtration chromatography. The crystals of ChuZ- hemin complex were obtained by the microbatch techniqu
15、e using Hampton 72 well crystallization plates (HR3- 086) and several Hampton crystallization kits such as Index, SaltRx, PEG/Ion Screen, Crystal Screen, PEG/Tacsimate, PEGRx were screened. 第三军医大学博士学位论文 4 3. Data collection and structure determination All diffraction data sets were collected at Beam line 17U of Shanghai Synchrotron Radiation Facility (Shanghai, China) using a MAR225 CCD detector . Structure of ChuZ was determined by molecular
