《黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及dna聚合酶γ表达的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及dna聚合酶γ表达的影响（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶表达的影响 作者：张涛 金英 魏晓东 王明富 王跃新 田丽华【摘要】 目的 探讨黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶表达的影响。方法 选用昆明小鼠，用D半乳糖致成亚急性衰老模型，并观察药物对小鼠呼吸链酶复合体、+的活性及DNA聚合酶mRNA的表达。通过RTPCR法检测衰老小鼠肝线粒体中DNA 聚合酶基因在mRNA水平的变化。结果 黄精多糖可提高衰老小鼠呼吸链酶活性，降低DNA聚合酶 mRNA的表达。结论 黄精多糖可以通过改善肝线粒体能量代谢，使DNA聚合酶 mRNA表达减少，提高呼吸链酶复合体、+而起到延缓衰老的作用。 【关键词】 黄
2、精多糖;线粒体;呼吸链复合体;DNA聚合酶许多研究证明，线粒体DNA(mtDNA)损伤呈增龄性积累，且与生物衰老之间存在高度的相关性1，2。线粒体氧化损伤程度受到线粒体抗氧化系统及修复系统的监控，其中碱基切除修复在监控线粒体DNA氧化损伤中起主要作用3。黄精多糖有抗衰老、抗肿瘤、抗炎、降低血脂血糖、增加机体免疫力等一系列作用。本实验观察黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶和DNA损伤和改善线粒体能量代谢方面提供部分理论依据。1 资料与方法1.1 药品和制剂 黄精多糖购于佳木斯医学院药店，经提取纯化并干燥。D半乳糖(Dgal)(上海试剂二厂);RTPCR试剂盒(大连宝生物公司) 。1.2 动物 昆
3、明小鼠，23月龄，雌雄各半，由佳木斯大学实验动物中心提供。随机分成青年对照组、衰老模型组、衰老模型黄精多糖大剂量组、中剂量组、小剂量组，每组18只。1.3 方法 衰老模型组及各给药组，每日上午颈背部皮下注射Dgal 100 mg/kg，青年对照组注射等量的生理盐水，连续4 w，造模完成后，第29天开始，模型给药组分别给予黄精多糖400、200、100 mg/kg予以灌胃，青年组、衰老组灌服等量的温开水，连续4 w。第56天末次给药前禁食12 h，给药1 h后颈椎脱臼处死，打开腹腔迅速取肝组织。1.4 样品制备1.4.1 制备10%肝组织匀浆 取肝脏0.5 g左右，在冷生理盐水中漂洗，滤纸拭干称
4、重，加入9倍体积预冷的匀浆介质，用电动匀浆机充分磨碎得组织匀浆。1.4.2 制备线粒体 取10%的肝组织匀浆，以2 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液以10 000 r/min高速冷冻离心机离心15 min，沉淀物即为线粒体，将分离的线粒体悬浮于冰冷的匀浆介质中制备成混悬液，反复冻融使线粒体膜破裂，备用。1.4.3 肝脏总RNA提取 取出的肝组织，用DEPC处理过的生理盐水清洗，锡纸包好，放入液氮中冻存。在液氮中研磨50100 mg放入1 ml Trizol内剧烈震荡，静置5 min，加氯仿200 l，震荡15 s，4 静置2.03.0 min，12 000 r/min离心1
5、5 min，取上清液置于EP管中，加异丙醇500 l，4 静置10 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清，用75%的乙醇1 ml洗沉淀，4离心7 500 r/min 5 min，弃上清，自然干燥。制成RNA溶液以分光光度法进行定量，测光密度A260/A280比值。采用甲醛变性电泳检测RNA完整性。1.4.4 PCR引物4 DNA聚合酶上游5TCAAGGAAGTCACGATGG3;下游5AGGCACTGGTCAATGTCTAC3，预计扩增片段470 bp。GAPDH上游5GGAGTTGCTGTTGAAGTCG3;下游5GTGCTGAGTATGTCGTGGAG3，预计扩增片段5
6、99 bp。1.4.5 RTPCR 参照TaKaRa RNA LA PCRTM Kit(AMV) Ver 3.0介绍的方法。混匀后置于30 10 min，50 30 min，99 5 min，5 5 min合成cDNA。PCR反应体系反应条件94 5 min，94 30 s，57 30 s，72 2 min，30个循环。1.4.6 电泳与凝胶成像 取4 l PCR扩增产物、2 l上样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶水平电泳上做产物检测分析，电压80 V，电泳1.5 h，EB 染色，经YLN2000凝胶成像分析系统照相分析，用DNA聚合酶 mRNA产物的OD值与GAPDH mRNA 产物的OD值作为D
7、NA聚合酶产物的相对含量。1.5 线粒体呼吸链酶复合体的测定5 在样品杯中加入0.2 mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液1.5 ml，10 mol/L铁氰化钾0.3 ml，线粒体悬浮液0.03 ml，0.1 mol/L氰化钾0.05 ml，用双蒸水补充体积至2.97 ml，加入0.1 mol/L NADH 30 l作为启动剂，在420 nm波长处进行检测。空白杯中用同体积分离介质代替线粒体悬浮液，不加NADH，其余加入试剂均同样品杯。单位定义：每毫克线粒体蛋白每分钟消耗NADH的mol数。氧化型辅酶的克分子消光系数E420=1.03 mmolL-1cm-1。1.6 线粒体呼吸链酶复合体+的测定
8、5 在样品杯中加入0.2 mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液1.5 ml，3 mmol/L EDTAK 0.3 ml，0.1 mmol/L氧化型Cytc 0.1 ml，0.1 mol/L氰化钾0.05 ml，线粒体悬浮液0.03 ml，用双蒸水补充体积至2.94 ml，加入1 mol/L琥珀酸60 l作为启动剂，在550 nm波长处进行检测。空白杯中用同体积分离介质代替线粒体悬浮液，并不加琥珀酸，其余加入试剂均同样品杯。单位定义：每毫克线粒体蛋白每分钟还原Cytc的mol/L数。线粒体MDA测定按试剂盒(南京建成生物公司)说明。1.7 统计学处理 所有实验数据应用SPSS 11.0软件进行统计
9、学处理，计量结果采用xs表示，经方差分析后，两组间比较采用t检验，多组间比较采用SNKq检验。2 结 果2.1 电泳和密度扫描分析结果 见图1。老年小鼠肝脏中DNA聚合酶 mRNA表达水平较高(0.6810.013)，黄精多糖各用药组DNA聚合酶 mRNA表达明显降低(0.4720.006，0.5110.01，0.5740.011，均P<0.05);黄精多糖各给药组之间差异无统计学意义。15：为GAPDH条带，依次分别为青年组、衰老组、多糖大剂量组、多糖中剂量组、多糖小剂量组;610：为DNA polymerase 条带，次序同15。图1 各组样本mtDNA PCR扩增产物电泳图2.2
10、各组样本中呼吸链酶复合体活性的变化 见表1。与青年对照组比较，衰老模型组小鼠肝线粒体呼吸链酶复合体、+活性降低(P<0.01)，MDA含量升高(P<0.01)。与衰老模型组比较，黄精多糖不同给药组复合体、+活性均升高(P<0.05);黄精多糖中剂量、大剂量明显优于小剂量组(P<0.05)，黄精多糖大剂量组与中剂量组比较无统计学意义。表1 黄精多糖对小鼠肝线粒体呼吸链复合体和+活性的影响与青年组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与衰老模型组比较：3)P<0.05;与黄精多糖小剂量组比较：4)P<0.053 讨 论本实验主要研究黄精多糖的抗衰
11、老作用及其机制。通过不同剂量黄精多糖干预D半乳糖致衰老模型小鼠，检测与衰老相关的肝线粒体呼吸链酶的活性及DNA聚合酶表达情况。黄精多糖可以清除自由基、提高抗氧化酶活力的研究虽有报道，但其是否也作用于核外遗传物质mtDNA，进而影响线粒体呼吸链复合酶活力、影响线粒体能量的合成尚未见报道。本实验研究的结果表明，三个剂量的黄精多糖均可以提高肝线粒体的抗氧化能力，对mtDNA氧化损伤有保护作用，能提高呼吸链酶的活性，使线粒体能量代谢和氧化磷酸化维持正常的水平，保证细胞的能量需求，维持正常的生理功能，达到延缓衰老的目的6。【参考文献】 1 Zeng ZH,Yu HS，Corbley MJ,et al.M
12、itochondrial DNA deletions are associated with ischemia and aging in Balb/c mouse brainJ.J Cell Biochem，1999;73 (4)：54553.2 de Grey AD.Three detailed hypotheses implicating oxidative damage to mitochondria as major driving force in home other agingJ. Eur J Biochem，2002;269(8)：1995.3 Wei YH，Lee HC.Ox
13、idative stress，mitochondrial DNA mutation and impairment of antioxidant enzymes in agingJ.Exp Biol Med (Maywood)，2002;227(9)：67182.4 孙 英,田 枫，刘新文,等.Balb/c小鼠增龄过程中不同脏器线粒体DNA损伤及损伤修复相关基因的变化J.中国生物化学与分子生物学报，2006;22(2)：1637.5 伍期专，陈 燕，陈清棠.线粒体肌病患者的线粒体呼吸及呼吸链酶复合体活力测定J.中华神经精神科杂志，1993;26(5)：2624.6 陈 红，杜冠华.线粒体与衰老J.中国药理学报，2001;16 (5)：4858.
