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1、1. 共聚焦显微镜定义：是指光路（激发和发射）在两个位置上聚焦。在共聚焦扫描仪中，激发光聚焦在样品点表面，而发射光聚焦在针孔上。这一针孔限制仪器在样品表面的聚焦深度，有效防止杂质信号（如灰尘荧光、样品背面的污染、玻璃的荧光信号、空气中常见的灰尘颗粒和来自扫描仪光学组件的荧光污染）产生的背景噪音干扰，从而降低背景信号的强度。优缺点：共聚焦显微镜最基本的优点是可以对厚荧光标本（可以达到 50 µm或以上）进行精细的光学切片，切片的厚度约为 0.5到 1.5µm。系列光学切片图像可以通过精确的显微镜 Z 轴步进马达上下移动标本获得。图像信息的采集被控制在精确的平面内，而不会被
2、位于标本上其他位置发出的信号干扰。在去除背景荧光影响和增加信噪比后，共聚焦图像的对比度和分辨率比传统场式照明荧光图像有明显的提高。分类：普通光照激发和激光激发两种原理：激光扫描共聚焦显微镜的主要原理是利用激光扫描束通过光栅针孔形成点光源，在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描，采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管(PMT)，再经过信号处理，在计算机监视屏上形成图像。对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好的会聚，可以全部通过针孔被探测器接收。而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑，对比针孔的直径大小，则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。而且随着距离物镜焦平面的距
3、离越大，样品所产生的杂散光在针孔处的弥散斑就越大，能透过针孔的能量就越少（由10%到1%，慢慢接近为0%），因而在探测器上产生的信号就越小，影响也越小。正由于共焦显微仅对样本焦平面成像，有效的避免了衍射光和和散射光的干扰，使得它具有比普通显微镜更高的分辨率，并在生物学中获得了广泛的应用。1构造：共聚焦显微镜主要由五部分组成：显微光学系统、扫描装置、光源、检测器和应用软件系统。整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。（1）显微光学系统：显微镜是共焦检测系统常用的组件，是系统成像质量的核心部分。显微镜光路一般采用无限远光学系统结构，可以方便地在其中插入光
4、学元件而不影响成像质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径、平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成像的清晰。物镜组的转换、滤色片组的选取、载物台的移动调节、焦平面的记忆锁定等都可以由计算机自动控制。（2）扫描装置：扫描装置是激光共聚焦检测系统进行大范围检测必需的组件，通常有由丝杠导轨组成的XY平移扫描、由阵镜摆动的扫描等方式。前种扫描方式可以实现大范围区域的扫描，而后者扫描范围相对小一些，不过阵镜摆动扫描可以很快，图像采集速度可以大大提高，有利于对那些寿命短的离子作荧光测定。扫描系统的工作程序由计算机自动控制，与信号采集相对应。（3）光源：光源有单色光（激光）和多色光（汞灯、氘灯、卤素灯等）。激光
5、源可以使用多谱线氩离子激光器，它提供发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光；另外，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器提供波长为633nm的红光。激光源还可以用其他半导体激光器。（4）检测器：检测器通常采用光电倍增管（PMT）、光子计数器等，通过高速A/D转换器，将信号输入计算机以便进行图像重建和分析处理。通常在PMT前设置针孔，可以采用固定大小针孔或由计算机软件来控制的可变大小针孔。如果是检测荧光，光路中还应该设置能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要；也可以采用光栅或棱镜分光然后进行光谱扫描。（5）应用软件系统：应用软件系统可以根据具体需要设置各种功能，
6、但有一点是共同的，就是将扫描位置坐标与检测器接收的信号一一对应起来，并以图像的方式进行储存与显示。激光激发共聚焦分类：针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜和双光子共聚焦显微镜：1）针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜：针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜是为了解决快速变化过程的共聚焦检测问题而提出的，其核心是双碟片专利技术，由日本Yokogawa Electric公司发明，包括微透镜阵列碟片与针孔阵列碟片同步旋转。与常规激光共聚焦方法不同，针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜采用CCD作为探测器，无需载物台进行扫描运动，只要微透镜阵列碟片与针孔阵列碟片同步旋转，就可以对物体进行快速共焦检测，最高全幅采集帧速度达到1000帧/
7、s，是活细胞在体荧光成像的重要工具。（2）双光子共聚焦显微镜：双光子共聚焦显微镜双光子共聚焦显微镜是为了解决生物检测中样品染料标记的光漂白现象而提出的，因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，这样就要求激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色（即光漂白现象），荧光信号会随着扫描进程的进行变得越来越弱。除此之外，还有光毒作用问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。针对活性样品的研究，尤
8、其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象将使这些研究受到很大的限制。双光子激发原理双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个较低能量（即更长的波长）的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个能量较高（即波长为长波长一半）的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100飞秒，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，
9、物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子共聚焦显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。双光子共聚焦显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子共聚焦显微镜比普通共聚焦显微镜更适合用来观察厚标本、活细胞，或用来进行定点光漂白实验。应用共聚焦显微镜有较高的分辨率，而且能观察到样本随时间的变化。因此，共聚焦显微技术在生物学
10、研究领域起着不可或缺的作用。以下为共焦显微技术的几个主要应用方面：3（1）组织和细胞中荧光标记的分子和结构的检测：利用激光点扫描成像，形成所谓的“光学切片”，进而可以利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图像，因此可以用于观察切片和一些表面不平的标本，特别是研究具有长突起的神经元时更有使用价值。同时可以做三维图像重建和标记强度的半定量分析。（2）定量或半定量测量Ca2+和pH等细胞内离子浓度及变化：激光扫描共聚焦显微镜可以提供更好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像，这对于研究钙等离子细胞内动力学有意义。最好与电生理等技术相结合来观察离子变化与电生理学指
11、标的相关性。（3）荧光光漂白及恢复技术：利用高能量激光束将细胞内某一部分中选定靶区域的某种荧光淬灭，然后观察邻近相同的荧光标记物重新扩散入该区域的速度和方式，从而分析细胞内蛋白质运输、受体在细胞膜上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。（4）长时程观察细胞迁移和生长：激光扫描共聚焦显微镜的软件一般均可自动控制地进行定时和定方式的激光扫描，而且由于新一代激光扫描共聚焦显微镜的探测效率的提高，只需要很小的激光能量就可以达到较好的图像质量，从而减小了每次扫描时激光束对细胞的损伤，因此，可以用于数小时的长时程定时扫描，记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。（5）其他的生物学应用：用高能量激光束进行细胞损伤
12、和损毁实验，一般要用紫外激光束进行细胞损毁；细胞间通讯研究；光解笼锁活化技术等。2. 细胞培养一、复苏1 1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37水浴锅中，轻微摇动（注意防止盖子不紧致使液体进入冻存管）。液体都融化后(大概1-1.5分钟)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里。2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来)，1000转离心5分钟。3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到37的5%CO2培养
13、箱中培养，细胞贴壁后换培养基。5.根据细胞增长速度2-3天换一次培养基。二、传代1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。2.把原有培养基吸掉。3.加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行)，消化1-2分钟。4.细胞都变圆后加入等体积的含血清的培养基终止消化。5.用移液枪吹打细胞，让细胞悬浮起来。6.把细胞吸到10ml或15ml的离心管中，1000转离心5分钟。7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。三、冻存把细胞消化下来并离心(同上)。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几
14、分钟，写明细胞种类，冻存日期。430min，-2030min，-80过夜，然后放到液氮灌中保存。冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。传代培养企业认领开放分类：分子生物学微生物学名词生物化学科学科学名词传代培养，当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。对单层
15、培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。传代方法/传代培养编辑1悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。培养材料/传代培养编辑1、无菌磷酸生理缓冲液(Dulbeccosphosphate-bufferedsaline,Ca+/Mg+free,D-PBS, GibcoBRL21600-010)2、trypsin-EDTAsolution(0.
16、05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：以10ml分装于15ml无菌离心管中，保存于20，使用前放在37水槽回温。3、新鲜培养基4、无菌吸管/离心管/培养瓶培养步骤/传代培养编辑传代培养中的细胞图册1、附着型胞(adherentcell)（1）吸掉旧培养液。（2）用D-PBS洗涤细胞一至二次。（3）加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加
