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1、绿色荧光标记C-反应蛋白的原核表达和毛细管电泳检测 作者：陈腾祥，夏高晓，陈丽，刘亚伟，刘靖华，姜勇【摘要】 目的： 表达纯化重组的His-EGFP-CRP蛋白，通过毛细管电泳技术对该重组蛋白的生物活性进行评价。方法: 用pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化、梯度透析，获得复性的His-EGFP-CRP蛋白；并用高效毛细管电泳（HPCE）技术对复性的蛋白进行检测，了解蛋白质的等电点及活性。结果: 转化实验发现，该质粒pET14b/EGFP-hCRP在BL21（DE3）中能够被诱导表达；通过包涵体变性溶解、亲和色谱
2、纯化可获得纯度较高的His-EGFP-CRP蛋白；HPCE分离发现复性后的His-EGFP-CRP蛋白峰为多个，其在电泳液pH值低于6时易检出，His-EGFP-CRP与THP-1细胞裂解物孵育后的检测峰增多。结论: 成功地在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达重组蛋白His-EGFP-CRP，通过包涵体变性溶解及亲和色谱纯化获得该重组蛋白，复性后的His-EGFP-CRP等电点接近于6，以单体或多聚体等结构形式存在，具有结合活性，能与细胞内相关分子结合成复合物，可应用于CRP功能和内化机制的研究。 【关键词】 C反应蛋白； 基因表达； 蛋白质复性； 电泳，毛细管Abstract Object
3、ive: To express the purified recombinant protein, His-EGFP-CRP, and to evaluate the feasibility of its application in the research of function and internalization mechanism of human C-reactive protein （CRP）. Methods: The re-constructed vector pET14b/EGFP-hCRP was transformed into Escherichia.coli BL
4、21（DE3）, induced by isopropyl-D-thiogalactopyranoside （IPTG）. The expressed protein, His-EGFP-CRP, was purified with affinity chromatography method and refolded with gradient filtration. The renatured His-EGFP-CRP was analyzed with high performance capillary electrophoresis （HPCE） to evaluate its is
5、oelectric point （pI） and bio-activity. Results: Fusion protein His-EGFP-CRP successfully expressed in transformed E. coli cells after the induction, and then was purified with inclusion lysis and affinity chromatography. His-EGFP-CRP was detected at several peaks of the fraction profile of HPCE when
6、 the pH of electrophoresis buffer was under 6. The number of His-EGFP-CRP detection peaks increased after the protein was incubated with lysate of THP-1 cells. Conclusions: The pI of His-EGFP-CRP is about 6, and its structures may be monomer or polymer, which have the ability to bind relative molecl
7、es in lysate of THP-1 to form complex. These results suggest the recombinant protein could be used in exploiting the function and internalization mechanism of human CRP.Key words C-reactive protein; gene expression; protein renaturation; electrophoresis,capillary C-反应蛋白（C-reactive protein, CRP）是一种发现
8、较早的蛋白质，在急性心肌梗塞、创伤、感染、炎症、外科手术和肿瘤侵润时，其血浆浓度急剧升高，达到正常水平的数百倍，乃至数千倍，可以作为上述疾病的临床监测指标，是急性期蛋白的主要成员之一1。CRP在免疫反应过程中能识别病原体和宿主受损细胞，介导补体系统和吞噬细胞将它们清除，发挥免疫调理功能2。除此之外，近些年来研究表明CRP的功能十分复杂，发现其能通过胞膜进入培养的主动脉内皮细胞，从而参与粥样动脉硬化症等心血管疾病的发生35。然而，对于CRP内化进入细胞的行为和机制还缺乏深入的研究，原因之一是纯化原核表达的CRP有较大难度，不易获得有体外活性的重组表达物。为解决这一技术难题，构建了带his纯化标签
9、和EGFP荧光标记的人CRP原核表达质粒4。在此工作基础上，对该融合蛋白的表达纯化和复性进行了探索，并利用高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis, HPCE）技术对复性后的重组蛋白进行检测分析，以进一步了解该重组蛋白的基本理化特点，检测该蛋白的活性。1 材料和方法1.1 材料台式低温高速离心机、台式冷冻离心机和PA800毛细管电泳仪（Beckman Coulter公司）；Mini VE垂直电泳系统（GE Healthcare公司）；原核表达质粒pET14b/MCS-EGFP及pET14b/EGFP-hCRP（分别由广东省蛋白质组学重
10、点实验室郭爱华和陈腾祥构建）；大肠杆菌菌株DH5（本室保存）；质粒纯化试剂盒（U-Gene公司）；异丙基-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside, IPTG）由Calbiochem公司生产；microcon YM-10超滤浓缩装置（Millipore公司）；TALON Metal Affinity Resin（BD Bioscience Clontech公司）；透析袋（Merck公司）；人单核细胞系THP-1（香港大学医学院徐爱民教授惠赠）；无内毒素的RPMI-1640培养液和胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）由Hyc
11、lone公司生产；protease inhibitor cocktail（sigma公司）。1.2 方法1.2.1 质粒pET14b/MCS-EGFP和pET14b/EGFP-hCRP的原核表达用pET14b/MCS-EGFP及pET14b/EGFP-hCRP分别转化BL21（DE3）大肠杆菌菌株，各挑取3个克隆到5 ml LB培养液（Amp+）中，37 振荡扩增，当菌液OD值约为0.4时，加入5 l 100 mmol/L IPTG到5 ml的菌液中，室温振荡4 h，取1 ml菌液3 000 r/min离心5 min，加入200 l 1倍SDS上样缓冲液重悬沉淀，进行SDS-PAGE电泳，考马
12、斯亮蓝染色观察蛋白表达情况。各取表达目的蛋白的克隆1 ml加入到200 ml LB培养液（Amp+）中，按上述表达条件进行大量诱导表达。1.2.2 His-EGFP蛋白的纯化按TALON Metal Affinity Resin试剂盒说明书，配制结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。200 ml转化了质粒pET14b/MCS-EGFP的大肠杆菌经室温诱导4 h后， 4 8 000 r/min离心菌液10 min，用4 ml 冰冷的结合缓冲液重悬细菌沉淀，超声波裂解，4 12 000 r/min离心20 min，取上清加入到装有TALON Metal Affinity Resin的纯化柱中，按操作
13、说明进行亲和色谱纯化。洗脱得到的纯化蛋白用Bradford方法定量。1.2.3 His-EGFP-CRP蛋白的纯化配制缓冲液A（50 mmol/L Tris-HCl、0.5 mmol/L EDTA、50 mmol/L NaCl、5甘油、0.5 mmol/L DTT，pH 7.9）。200 ml转化了质粒pET14b/MCS-EGFP-CRP的大肠杆菌经室温诱导4 h后， 4 8 000 r/min离心菌液10 min，用10 ml含 5TritonX-100缓冲液A重悬沉淀，超声波裂解细菌，4 12 000 r/min离心20 min。沉淀（主要为包涵体和细菌碎片）转入5 ml的玻璃匀浆器内，
14、加入10 ml含5TritonX-100的缓冲液A充分匀浆沉淀，室温静置20 min，匀浆液离心后取沉淀重复匀浆洗涤1次。加入10 ml含3十二烷基肌氨酸钠（SKL）和0.3十二烷基硫酸钠（SDS）的buffer A，充分重悬沉淀，静置60 min以缓慢溶解包涵体。溶解产物4 12 000 r/min 离心20 min，取上清加入到microcon YM-10中，超滤浓缩到原体积的1/2。然后加入到TALON Metal Affinity Resin的纯化柱中，进行亲和色谱纯化。洗脱得到的纯化蛋白用Bradford方法定量。1.2.4 SDS-PAGE检测质粒原核表达和蛋白纯化情况分别取少量未
15、转化质粒的BL21（DE3）、诱导表达的转化子、转化子菌液裂解后的离心沉淀物及上清、亲和纯化的洗脱液，加入SDS上样缓冲液，进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色观察蛋白表达和纯化情况。1.2.5 蛋白质重折叠复性及缓冲液置换上述亲和纯化得到的His-EGFP和His-EGFP-CRP蛋白液分别加入到截留分子量为10 kD透析袋中，放入到500 ml含0.5 mmol/L DTT的Buffer A中，4 透析12 h，每3 h更换透析液；将透析袋放入另一个500 ml的透析体系（含1 mmol/L GSH、0.2 mmol/L GSSG和0.6 mmol/L L-精氨酸的PBS）中，4 透析12
16、 h，每3 h更换透析液；最后放入500 ml PBS溶液中，4 透析3 h，重复4次。用0.22 m的滤膜过滤除菌，Bradford方法定量，分装后贮存于-80 。1.2.6 荧光蛋白的高效毛细管电泳检测分别取纯化后的His-EGFP和His-EGFP-CRP的蛋白样品，用PBS将浓度稀释为100 mmol/L，按操作说明加入到毛细管电泳仪PA800的专用样品管内以备进样检测；检测器选用激光诱导荧光（laser induced fluorescence, LIF）模组，检测波长为488 nm；毛细管柱为N-CHO内涂层的石英毛细管，内径50 m，总长度为50.2 cm，从进样端至检测窗口的长度为40 cm；采用真空抽吸进样，压力为2 psi，进样时间10 s，电
