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1、缺血预处理对大鼠肝移植缺血再灌注损伤后CyclinD1和CyclinE表达的影响 作者：裴旭东，叶启发，肖建生，明英姿，牛 冰 【摘要】 目的 探讨缺血预处理(IP)对大鼠肝移植缺血再灌注（IR）损伤后肝CyclinD1和CyclinE表达的影响，以了解移植肝再生能力和功能不良的影响因素。方法 将SD大鼠90只随机分为缺血预处理组（IP组）、对照组（OLT组）和假手术组（SO组）3组；用全自动生化分析仪来检测肝功能；通过免疫组化S-P法来测定移植肝CyclinD1和CyclinE的变化。结果 对照组中大鼠移植肝缺血再灌注损伤后血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)明显升
2、高，CyclinD1和CyclinE的百分含量较低，提示移植肝细胞再生不良；实验组经缺血预处理后血清中ALT、AST稍升高，幅度<对照组，CyclinD1和CyclinE的百分含量很高，提示移植肝细胞再生活跃。结论 缺血预处理能够启动内源性保护移植肝的相应机制，可促进肝CyclinD1和CyclinE的合成，激发肝细胞的增殖和再生。 【关键词】 大鼠肝移植；缺血再灌注；缺血预处理；CyclinD1；CyclinE 【Abstract】 Objective To approach expressed influence of CyclinD1 and CyclinE in period o
3、f ischemia-reperfusion(IR) post injury of liver transplant by ischemia-pretreatment (IP) in rat， with a view to comprehend influence factor of transplanted liver regeneration capacity and dysfunction.Methods Ninety SD rats were randomly divided into three groups：ischemia-pretconditioning group (IP g
4、roup)，control group (OLT group) and sham operation group (SO group)；to detect hepatic function by automatic biochemistry analyzer；to determine changes of CyclinD1and CyclinE of transplanted hepatic cell by immunity histochemistryS-P method.Results Serum ALT，AST obviously stepped up of control group
5、rat of transplanted liver ischemia-reperfusion postinjury， percent content lied low comparatively；to hint dysregerated of transplanted hepatic cell.Serum ALT， AST sightly heighten， and content little to control group，in experiment group rat of being ischemia-pretconditioned， percent content express
6、quite hight，to hint transplanted hepatic cyothesis active.Conclusion Ischemia- pretconditioned can switch on corresponding mechanisms of endogenous conserve transplanted liver，be able to promote synthesis of CyclinD1and CyclinE，to stimulate hepatocelluar multiplication and regeneration. 【Key words】
7、rat transplanted；ischemia-reperfusion；ischemia-pretconditioning；CylinD1；CyclinE 缺血再灌注(IR)损伤普遍贯穿于肝移植始终，它是临床上肝移植术后原发性移植物无功能的首要因素。Sasaki等证实IR损伤可使鼠移植肝细胞凋觯?，近年来的研究也表明肝脏再生能力的大小也是IR损伤后移植肝功能恢复的关键环节。缺血预处理（IP）是公认的对肝脏IR损伤有保护作用2。为研究移植肝IR损伤程度与肝细胞再生能力的关系，本实验以移植肝IR损伤后CyclinD1和CyclinE的表达作为细胞增殖指标，以检测IP对IR损伤后移植肝细胞增殖的
8、影响，从而进一步探讨肝移植术后肝功能不良的原因。 1 材料与方法 1.1 实验动物与分组 纯系Wistar雄性大鼠90只，体重280320mg，由湖南农业大学实验动物研究中心提供。普通喂养，自由进食，术前12h禁食，将大鼠随机分为3组：（1）取样缺血预处理组(IP组)：即在供肝冷转灌注前缺血处理10min，10min再灌注，循环2次，然后行双袖套法原位肝移植术。术后2h、6h、24h各时间点取肝脏标本和经下腔静脉采血4ml待测。各时间点分别取样6只。（2）对照组 (OLT组)：即单纯行双袖套法原位肝移植术，术后2h、6h、24h各时间点取肝脏标本和经下腔静脉采血4ml待测。各时间点分别取样6只
9、。（3）假手术组（SO组）：即血流阻断与复流及原位肝移植外，其余处理同上。分别取样6只。 1.2 实验器械与试剂 肝功能检测用全自动生化分析仪（AU800 Olympus）。免疫组化试剂CyclinD1单克隆抗体(兔抗大鼠），购于北京中杉金桥生物技术有限公司；CyclinE单克隆抗体（兔抗大鼠），购于上海长岛生物技术有限公司；DAB显色试剂购于福州迈新生物技术有限公司。 1.3 方法 1.3.1 原位肝移植模型的建立 按照Kamada3和孙君泓4报道的术式建立大鼠原位肝移植模型：即不重建肝动脉的双袖套法大鼠肝移植术。 1.3.2 标本的制备和测定方法 取移植肝组织用4%的复合甲醛固定待制石蜡标
10、本，行光镜学检查及行免疫组化S-P法检查，同时将所采静脉血2ml，11000r/min离心5min取血清置于-70深低温水箱保存检测转氨酶。 1.4 结果判断标准 由两位病理医生在光镜200倍视野下，每张切片取5个视野，用HPIAS1000型彩色图像分析仪系统测定CyclinD1和CyclinE表达情况，结果用阳性细胞率来表示：阳性细胞率（%）=视野中阳性细胞数/视野中总细胞数 100%。 1.5 统计学方法 所有数据以均数标准差（xs）来表示，以SAS统计软件包分析处理，多个样本均数间比较用重复测量设计方法分析和单因素方差分析，IP组与OLT组比较用t检验。 2 结果 2.1 一般情况 该部
11、分供肝手术时间、血管袖准备时间和受体手术时间分别为（303.30）min、(113.83)min和（31.53.20）min。其中无肝期为1822min，平均（19.671.63）min，手术成功率94.1%。未处死的大鼠1周存活率达88%，最长存活72天。 2.2 各组血清ALT、AST含量 见表1。OLT组各时间点ALT、AST较SO组显著升高，且随再灌注时间延长而逐步升高，以移植肝再灌注2h升高最为明显，以后升高幅度降低。IP组各时间点ALT、AST升高幅度远低于OLT组，与之相比较，P<0.01。 2.3 移植肝细胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE标记阳性细胞率 SO组C
12、yclinD1、CyclinE均未发现阳性表达。IP组各时间点CyclinD1、CyclinE阳性细胞率均高于OLT组，尤以624h升高明显；而IR组6h细胞凋亡显著升高，增殖低下，24h仍维持很低水平。24h CyclinD1与CyclinE阳性细胞率分别为0.470.23、0.440.21与OLT组0.21011、0.200.08比较，差异具有非常显著性（t=7.57，P<0.01），见表2。笔者还发现CyclinD1表达时限等同于CyclinE的表达，阳性细胞表达率高于CyclinE的表达率。表1 移植肝IR损伤后血清ALT、AST含量变化 （xs，u/L）注：同时间点IP组与OL
13、T组相比较，P<0.01表2 移植肝IR后细胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE阳性细胞率表达 （xs）注：IP组与OLT组相比较，P<0.05；IP组与OLT组相比较，*P<0.01 2.4 光镜下肝脏病理组织学变化与SO组肝脏组织相比较 OLT组（见图1、图2）中肝脏细胞广泛水肿，以中央静脉周围为主，肝组织结构混乱可见小滴样脂肪变性，肝窦内大量中性粒细胞浸润；灌注后24h可见部分肝窦狭窄，并有红细胞残片，界板破坏。而IP组（见图3、图4）仅有轻度肝细胞水肿，肝窦内有少许中性粒细胞散在，小叶结构基本完整。 3 讨论 IR引起损伤已在多种组织器官缺血再灌注模型中得到证实
14、。Borghi5等观察16例临床原位肝移植术后细胞凋亡情况，发现IR后肝细胞发生一系列代谢、结构和功能的改变， 导致转氨酶升高，酶泄漏的发生，线粒体功能受损，活性氧化剂的增多，由此认为肝细胞的凋亡与肝IR损伤有关。本实验血生化结果证实了这种变化，并观察到OLT组随着再灌注时间的延长， 转氨酶(ALT、AST) 呈进行性升高。6h血清ALT、AST迅速升至最高，提示细胞严重受损，酶泄露严重；24h ALT、AST升高幅度开始回落，细胞修复能力加强；组织病理学检查有明显变化，并随灌注时间延长而加重。说明肝缺血再灌注损伤引发的细胞凋亡为一种动态过程，其原因可能是在不同阶段参与损伤的因素不同，是由多种
15、因素综合作用的结果所致。Schlossberg6等观察小鼠肝IR损伤后细胞凋亡和组织修复的相关指标时发现细胞凋亡在肝叶IR后6h达峰值，且持续升高到20h以上，并在IR损伤急性期（13h）和亚急性期（620h）由不同的受体途径介导。在实验中，OLT组中CyclinD1、CyclinE的表达达最低值。 IP减轻肝IR损伤后肝细胞凋亡和增强细胞再生能力，目前已广泛证实，但其机制十分复杂；它与腺苷、一氧化氮、热休克蛋白、蛋白激C酪氨酸激酶依赖性信号系统、K+ ATP通道的激活等诸多因素有关7。本实验发现IP可通过上调（肝细胞抗凋亡基因bcl-2）活性来下调Fas凋亡途径中Fas-mRNA的表达和抑制
16、caspase-3的活性8，使细胞内容物（如DNA）避免氧化损伤，促使细胞周期中G1/S的转化启动，从而完成细胞再生9。Kuo10观察临床肝移植术后细胞凋亡情况时发现肝细胞凋亡与IR造成的生化损伤及病理学损伤参数改变呈正相关。实验中IP组肝移植前给予10min缺血，10min再灌注2次，血清转氨酶幅度较OLT组明显降低（P<0.01），病理变化显示肝细胞轻度水肿，小叶结构完整，超微结构变化示细胞膜结构完整，酶泄露少。再灌注后24h作为细胞周期正性调节蛋白CyclinD1与CyclinE在IP组24h的阳性表达率显著高于OLT组，提示移植肝细胞凋亡机制受限，肝细胞增殖机制活动增强。 增殖性细胞周期分为DNA及蛋白质合成准备期G1期、DNA合成期
