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1、稳定表达丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶的HepG2细胞克隆的建立 作者：雷迎峰，尹文，薛小平，杨敬，吕欣，韦三华，胡兴斌，孙梦宁，徐志凯【关键词】 丙型肝炎病毒 Establishment of stably transfected HepG2 cell line expressing HCV scNS4A/NS3 protease【Abstract】 AIM: To construct a eukaryotic expression vector of HCV single chain serine protease (scNS4A/NS3) and to obtain its stably
2、transfected HepG2 cell line. METHODS: According to the sequence of HCV scNS4A/NS3 gene from the literature, the primers amplifying the gene coding scNS4A/NS3 protease were designed. HCV RNA was extracted from the HCV positive serum and the gene coding scNS4A/NS3 protease was amplified via RTPCR. The
3、 PCR product was digested by BamH/Hind and purified by gel extraction. This fragment was inserted into pcDNA3.1(-) with T4 ligase and transformed into E.coli JM109. The positive recombinant plasmid was selected and identified via sequence assay and restrictive enzyme digestion. The recombinant plasm
4、id was then transfected into HepG2 cell by LipofectAMINE2000. The cells containing stable transformants were selected by the ability of resistance to G418. The stably transfected cell line was identified by RTPCR and IFA and Westernblot. RESULTS: The eukaryotic expression vector named pcDNA3.1(-)scN
5、S4A/NS3 was successfully constructed and the stably transfected HepG2 cell line which expressed scNS4A/NS3 protease was obtained. CONCLUSION: The stably transfected HepG2 cell line expressing single chain serine protease facilitates the establishment of cellbased system in evaluating antiHCV serine
6、protease drug.【Keywords】 hepatitis C virus; single chain serine protease; lipofectamine, transfection; colone cells【摘要】 目的：构建丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶（scNS4A/NS3）的真核表达载体；建立重组质粒稳定转染的HepG2细胞克隆. 方法：根据文献报道设计扩增scNS4A/NS3编码基因的引物，从HCV阳性患者血清中提取病毒RNA，RTPCR方法扩增出scNS4A/NS3基因片段， BamH/Hind双酶切后连接到经同样酶切的真核表达载体pcDNA3.1(-)，转化菌
7、株JM109感受态细胞，获得重组质粒pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3，经酶切鉴定及序列测定. 将阳性重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞，经持续G418压力选择和克隆化获得稳定转染的细胞系，用RTPCR，IFA，Westernblot证实该稳定细胞系可以表达单链丝氨酸蛋白. 结果：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3；建立了稳定转染的HepG2细胞克隆，命名为scpHepG2. 结论：获得稳定的scpHepG2细胞克隆可表达单链丝氨酸蛋白，为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物系统奠定基础.【关键词】 丙型肝炎病毒；单链丝氨酸蛋白酶；转染，
8、脂质体法；细胞克隆0引言稳定、可靠的细胞培养系统和小动物实验模型的缺乏极大地制约着抗丙型肝炎病毒(HCV)研究的深入和发展1. 因此以在HCV RNA复制和蛋白前体加工成熟中起着关键作用的酶分子为靶位的测定系统常被用于抗HCV 药物的筛选. 酶抑制剂作为一个有潜力的药物分子，它不仅需要有效，也需要有良好的药物动力学等特征，如易进入细胞、结构稳定. 所以建立一种可以在细胞水平上评价酶活性的细胞系统非常关键. NS3丝氨酸蛋白酶在HCV多聚蛋白前体加工成熟中起关键作用，是抗HCV研究的主要靶标分子2. 我们通过构建HCV单链丝氨酸蛋白酶（scNS4A/NS3）的真核表达载体，获得重组质粒稳定转染的
9、HepG2细胞克隆，为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物的系统奠定基础.1材料和方法1.1材料E.coli. JM109菌株、pcDNA3.1(-)质粒由本室保存. Taq DNA聚合酶、限制性内切酶BamHI，Hind等购自TaKaRa公司，胶回收试剂盒购自Vgene公司，T4 DNA连接酶购自上海生物工程公司，FITC和HRP标记羊抗鼠IgG, DNA分子标准、低分子蛋白质标准分别购自华美生物工程公司. 反转录试剂盒Superscript，Trizol，Lipofecatmine2000，G418购自Gibco公司. NS3mAb由本室制备3.1.2方法1.2.1HCV
10、RNA的提取与cDNA第一链的合成以HCV阳性患者的血清为材料提取病毒RNA，方法参照Trizol说明书，将RNA沉淀溶于20 L不含RNase的去离子水. 反转录按Superscript说明书进行，模板为病毒RNA，反转录引物为scNS4A/NS3基因下游引物，最后获得cDNA第一链.1.2.2scNS4A/NS3基因的PCR扩增参考文献4，设计扩增scNS4ANS3基因的引物: P1,5 CGGATCCATGGCGCCTATCGGCTCAGTAGTAATCGTAGGCAGAATCATCCTGTCCGGCCGTGGTGGCCCTATTACGGCCTACTCCCAAC 3; P2, 5 CGC
11、GGTACCTAGGCAAAACCAGAACCAGC 3. 上述引物均由上海生工公司合成. 以病毒cDNA第一链为模板扩增scNS4A/NS3基因，体系为：模板5 L，10Buffer 5 L ，10 mmol/L dNTPs 4 L，p1，p2各2 L，Taq 2 L，用超纯水补至终体积50 L. 条件: 预变性94 5 min，94 1 min，60 50 s，72 1 min共 30个循环， 72延伸10 min. 质粒构建按参考文献5进行，获得pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3重组质粒. 酶切进行鉴定并交由上海生工公司测序.1.2.3细胞培养和G418工作浓度的确定常规培养He
12、pG2细胞于12孔板中，50 mL/L CO2，37，培养基为RPMI 1640 (100 mL/L胎牛血清,100 mg/L青、链霉素,2 mmol/L谷氨酰胺)，至细胞密度达90%布满时，加入含G418的培养液1 mL/孔（G418终浓度分别为2001000 mg/L，8孔）. 换液时保持G418浓度稳定不变，持续培养34 wk.1.2.4细胞转染与筛选稳定细胞克隆质粒制备：将pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3质粒转化大肠杆菌感受态细胞JM109，挑取菌落接种5 mL LB，37振摇，12 h后离心收菌. 用去内毒素超纯质粒提取试剂盒（博大泰克公司）提取质粒，紫外分光光度法测定DN
13、A含量和纯度. 细胞转染：将HepG2细胞培养于24孔板，待细胞90%铺满，采用脂质体法转染pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3,具体操作按LipofectAMINE 2000说明书进行. 建立稳定的细胞克隆：采用G418压力选择. 上述转染48 h后，通过G418压力筛选2 wk后，细胞成团，用枪头挑取单个细胞团种在96孔板，继续加G418压力选择，直到最后获得单独稳定生长的细胞克隆，扩大培养后检测并冻存. 获得的细胞克隆冻存2 mo后复苏，检测细胞克隆的稳定性.1.2.5稳定转染细胞系的检测RTPCR检测稳定转染细胞中目的基因的mRNA： 将稳定生长的细胞用PBS清洗一次后，参照说明
14、书用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，然后反转录合成cDNA，按SuperScriptTM II反转录试剂盒（Gibco公司）操作说明进行. 用P1和P2对反转录产物进行PCR. PCR反应体系及反应条件同前. 免疫荧光检测：用胰蛋白酶消化稳定生长的细胞，吹匀，将之加入镀膜片小孔中，每孔15 L，置于湿盒中，37, 50 mL/L CO2培养箱培养12 h，40 g/L多聚甲醛固定，NS3 mAb作为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗，500 g/L的甘油封闭后在荧光显微镜下观察. 同时以转染空质粒pcDNA3.1（-）的HepG2做为对照. Westernblot检测目的蛋白的表达:
15、在六孔板中培养稳定转染的细胞，待细胞铺满后，用PBS清洗细胞3次，然后每孔加入100 L 2SDS上样缓冲液，用细胞刮刀将细胞分离置于离心管中. 用细胞超声粉碎仪破碎细胞，煮沸5 min，离心收集上清备用，同时用空质粒转染的HepG2做对照. 按Biorad垂直电泳仪说明书，配置40 g/L浓缩胶和120 g/L分离胶，取20 L细胞处理液上样，电压120 V，1.5 h后将蛋白转移至醋酸纤维素膜（NC），NS3 mAb作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，DAB显色.2结果2.1PCR产物和重组质粒的鉴定结果取PCR产物5 L行10 g/L琼脂糖电泳结果显示扩增出约590 bp的片段,
16、大小与目的片段相符. 重组质粒经BamH/Hind酶切后，酶切产物大小与预期相符（图1），说明重组真核表达载体构建正确. 序列测定结果与文献报道相同.2.2G418工作浓度的确定可观察到1000，900，800 mg/L孔于第2日，700和600 mg/L孔于第3日，500，400，300 mg/L孔于第5日，200 mg/L孔于第6日开始出现生长抑制现象，细胞开始溶解. 20 d后，G418浓度700 mg/L的各孔细胞稳定生长，而1000，900，800 mg/L的3孔相继全部死亡. 可以认为在本实验条件下G418的最佳工作浓度为800 mg/L.2.3稳定转染HepG2细胞系检测2.3.1RTPCR检测稳定转染细胞的目的基
