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1、稳定表达EGFRvIII的U87MG细胞株的建立与鉴定 作者：陈明 孙红宇 文荣朝 余政梁 吴巧琪 夏许可 张兴梅 高天明【摘要】 目的：构建稳定表达表皮生长因子受体III型突变体(EGFRvIII)的U87MG细胞株。方法：采用电转染方法将pcDNA4/TOEGFRvIII质粒导入U87MG细胞，加入zeocin筛选，进一步将细胞有限稀释并克隆化培养以建立稳定的转染细胞株。应用RTPCR、Western blot及细胞免疫荧光染色方法鉴定稳定表达EGFRvIII基因的细胞株。结果：经RTPCR鉴定发现V6号和V24号单克隆细胞株EGFRvIII基因mRNA水平高表达，进一步Western b
2、lot及细胞免疫荧光染色方法鉴定发现V6号细胞株EGFRvIII蛋白水平高表达。结论：成功建立了稳定表达EGFRvIII的U87MG细胞株，为进一步的抗肿瘤治疗及其机制研究提供基础。 【关键词】 EGFRvIII; U87MG细胞; 基因表达表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)在胶质瘤等多种恶性肿瘤中过表达，并与肿瘤恶性程度相关，然而EGFR表达也见于正常组织，并存在多种EGFR突变体，限制了以EGFR为靶标的抗肿瘤治疗。最常见的EGFR突变体是EGFRvIII(epidermal growth factor receptorvari
3、ant III)，为EGFR的胞外区27外显子产生框内缺失而形成，这种突变体只在肿瘤细胞中出现，而在正常组织中不表达，因此是一个很好的肿瘤治疗靶标1。本研究建立了稳定表达EGFRvIII的U87MG细胞株，为进一步的抗肿瘤治疗及其机制研究提供基础。1 材料和方法1.1 材料人恶性胶质瘤细胞系U87MG由南方医科大学神经生物学教研室保存，A431细胞购自中山大学实验动物中心细胞库。pcDNA4/TOEGFRvIII质粒由University of Texas Southwestern Medical Center的Amyn A. Habib教授惠赠。DMEM培养基及Zeocin购自Invitro
4、gen公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，小鼠抗EGFR单克隆抗体购自Biosource公司，RNAiso试剂购自TaKaRa公司，RTPCR试剂盒购自Promega公司，RTPCR引物在TaKaRa公司合成。1.2 U87MG细胞培养及转染U87MG培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37、5% CO2培养箱常规培养。转染前23天进行细胞传代。1.3 细胞转染及稳定株筛选采用amaxa电转染仪电转染细胞。转染时胰酶消化并离心收集细胞，计数并准备5105个细胞/电转染。将细胞重悬于100 l电转液并加入2 g pcDNA4/TO或pcDNA4/TOEGFRvIII质粒进行电转染，然后置
5、于37、5% CO2培养箱常规培养。转染后24小时免疫荧光染色观察瞬时转染效果。培养细胞中加入zeocin工作液，终浓度100g/ml，每3天换培养液。培养14天后，将细胞有限稀释并克隆化培养于96孔培养板中，倒置显微镜下观察并挑选单克隆细胞进一步扩大培养并鉴定。1.4 RNA抽提及反转录聚合酶链反应(RTPCR)RNA抽提采用RNAiso裂解细胞，加入氯仿离心后收集上清层，然后异丙醇、乙醇沉淀得到总RNA。用于检测EGFR和EGFRvIII的RTPCR引物序列为：5CAGTATTGATCGGGAGAG3和5 CATCTCATAGCTGTCGGC3。反应体系中含有dNTP 0.2 mM，引物各
6、1 M，MgSO4 1 mM，AMV逆转录酶0.1 U/l，Tfl DNA聚合酶0.1 U/l，RNA模板1 l，设置无模板对照，以高表达EGFR基因的A431细胞作为阳性对照。RT反应条件为：45，5 min;94，2 min。PCR反应条件为：94，30 s;60，1 min;68，2 min;反应30个循环后，68，7 min。同时进行GAPDH的RTPCR作为内参照。反应结束后进行2%琼脂糖凝胶电泳观察并摄相。1.5 蛋白免疫印迹(Western Blot)按照我们以前报道的方法2，细胞用PBS洗2次，加入细胞裂解液(62.5 mM Tris，5% 巯基乙醇，2% SDS，10% 甘油
7、及0.05%溴酚蓝)室温抽提蛋白质。取蛋白样品进行8% SDSPAGE电泳后电转移至PVDF膜。室温下用含5%脱脂奶粉的0.1% Tween20/TBS(TBS/T)封闭1 h，TBS/T漂洗后一抗(1:500稀释于含5% BSA的TBS/T)4孵育过夜。TBS/T漂洗后，再将膜与FITC荧光标记的二抗(1:5000)室温下孵育1 h，漂洗后进行化学发光检测，于凝胶成像仪中摄像。1.6 细胞免疫荧光染色4%多聚甲醛固定细胞，PBS漂洗后室温封闭1 h，滴加1:200稀释的一抗于4孵育过夜，PBS漂洗，FITC标记的二抗(1:1000)室温孵育1 h。DAPI(1 g/ml)衬染细胞核后于荧光显
8、微镜下观察并摄像。2 结果2.1 RTPCR检测EGFRvIII基因的表达1：DNA Marker;2：A431细胞;3：V24号克隆;4：V10号克隆;5：V6号克隆;6：pcDNA4质粒转染单克隆;7：未转染U87MG细胞;8：无模板对照。图1 RTPCR方法检测单克隆细胞株EGFRvIII表达如图1所示，RTPCR反应扩增后，阳性对照A431细胞检测到EGFR基因表达(998 bp)，V24号和V6号单克隆细胞株检测到EGFRvIII基因(197 bp)表达，V10号单克隆细胞株未检测到目的基因表达。各细胞株均检测到作为内对照的GAPDH基因(171 bp)。2.2 Western bl
9、ot检测EGFRvIII蛋白的表达如图2所示，阳性对照A431细胞检测到EGFR蛋白表达(170 KDa)，U87MG细胞本身不表达EGFRvIII蛋白，V6号单克隆细胞株检测到EGFRvIII蛋白强表达，V10号单克隆细胞株检测不到EGFRvIII蛋白表达。1：A431细胞;2：未转染U87MG细胞;3：V6号克隆;4：V10号克隆。图2 各单克隆细胞株细胞EGFRvIII基因的蛋白水平表达2.3 细胞免疫荧光染色检测EGFRvIII的表达免疫荧光染色显示，不含目的基因的对照质粒pcDNA4/TO转染后筛选得到的单克隆细胞株未见到EGFR或EGFRvIII蛋白表达，而稳定转染pcDNA4/T
10、OEGFRvIII质粒的V6号单克隆细胞株可见EGFRvIII蛋白表达，且表达主要位于细胞膜上(图3)。左上和左下：分别为转染空载体pcDNA4/TO后免疫荧光检测EGFRvIII蛋白表达和DAPI染核。右上和右下：分别为V6号单克隆细胞株免疫荧光检测EGFRvIII蛋白表达和DAPI染核。图3 细胞免疫荧光染色检测到V6号细胞株EGFRIII蛋白大量表达(400)3 讨论胶质瘤占所有脑肿瘤的70%，其中多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)是最常见的脑肿瘤，预后极差，其五年存活率不到3%3。传统的治疗方法主要包括外科手术切除、放射治疗和化疗，但受到放射治
11、疗的剂量、血脑屏障对药物不通透等多种因素影响，疗效受到明显限制4。对GBM发病分子机制的研究为疾病治疗带来了新的希望。研究发现，EGFR基因扩增、突变及重排常见于GBM，可促进肿瘤生长、侵袭和治疗抗性。EGFRvIII是最常见的EGFR突变体，约占人类GBM的50%。EGFRvIII胞外段缺失了267个氨基酸而丧失与配体结合的能力，但其胞内段酪氨酸激酶仍然保持组成性激活，导致内化和降解过程减弱，产生持续的下游信号传导，致使其致瘤性显著增强1,5。EGFRvIII仅存在于恶性肿瘤细胞，在正常组织中不表达，因而是一个很好的肿瘤治疗靶标1。目前针对EGFRvIII的靶向治疗研究主要包括开发下游信号传
12、导分子特异性抑制剂、EGFRvIII特异性抗体、肿瘤疫苗，EGFRvIII特异性核酶等6,7。U87MG细胞是人恶性胶质瘤细胞，该细胞不表达EGFRvIII基因，获得稳定表达EGFRvIII的U87MG细胞株可为开展胶质瘤发生发展的分子机制及抗肿瘤治疗研究提供有力的工具。例如，利用EGFRvIIIU87MG稳定细胞株，可以在培养细胞模型上寻找新的介导GBM细胞增殖、侵袭以及治疗抗性的细胞信号转导分子，筛选有效的下游信号分子抑制剂，以及开发同时以多个下游信号分子为靶点进行联合治疗的新方法8。另外，将EGFRvIIIU87MG稳定细胞株接种小鼠制备成荷瘤小鼠模型，可在在体水平研究GBM的生长特性及
13、进行抗瘤效果测试9。本研究中，我们利用电转染方法首先获得了瞬时表达EGFRvIII基因的U87MG细胞，经过抗生素ziocin筛选抗性克隆，扩大培养后采用RTPCR、Western blot以及免疫荧光染色方法鉴定，发现V6号细胞株在mRNA水平及蛋白水平均高表达EGFRvIII基因。因此，我们成功构建了稳定表达EGFRvIII的U87MG细胞株，为进一步的抗肿瘤治疗及其机制研究提供了基础。【参考文献】 1Gan HK, Kaye AH, Luwor RB. The EGFRvIII variant in glioblastoma multiforme. J Clin Neurosci, 20
14、09, 16: 748754.2 Chen M, Sun HY, Li SJ, et al. Nitric oxide as an upstream signal of p38 mediates hypoxia/reoxygenationinduced neuronal death. Neurosignals, 2009, 17: 162168.3 Ohgaki H. Epidemiology of brain tumors. Methods Mol Biol, 2009, 472: 323342.4 Wong ML, Kaye AH, Hovens CM. Targeting maligna
15、nt glioma survival signalling to improve clinical outcomes. J Clin Neurosci, 2007, 14: 301308.5 Friedman HS, Bigner DD. Glioblastoma multiforme and the epidermal growth factor receptor. N Engl J Med, 2005, 353: 19971999.6 张兴梅, 石玉生. 针对表皮生长因子受体III型突变体的抗肿瘤研究进展. 国际肿瘤学杂志, 2006, 33: 804807.7 Voelzke WR, Petty WJ, Lesser GJ. Targeting the epidermal growth factor receptor in highgrade astrocytomas. Curr Treat Options Oncol, 2008, 9: 2331.8 Stommel JM, Kimmelman AC, Ying H, et al. Coactivation of receptor tyrosine
