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1、疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞PI3K p85蛋白表达的影响 作者：杨钦河 欧健 孙升云 乔娜丽 程少冰 陈万群 金玲 杨环文 李娜 纪桂元 谢维宁 林秀峰 张玉佩 薛川松【摘要】 目的 观察疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠肝细胞磷脂酰肌醇3激酶p85(PI3K p85)表达的影响。方法 以高脂饮食12周建立大鼠NAFLD模型后，造模组大鼠再随机分为模型组、疏肝组、健脾组、综合组和自然恢复组等5组。治疗组分别给予相应药物灌胃，其他组给予等量蒸馏水灌胃，模型组继续高脂饮食，其余均予基础饲料喂养。治疗8周后，用3%戊巴比妥腹腔麻醉，腹主动脉取血，全自动生化仪检测血脂及
2、肝功，稳态模型法评价胰岛素抵抗程度，光镜下观察各组肝脏病理改变，免疫组化方法检测肝细胞内PI3K p85蛋白的表达情况。结果 与模型组相比，药物治疗各组及自然恢复组肝脏脂变程度明显减轻，肝功、血脂、胰岛素抵抗均有显著改善（P<0.05或P<0.01），肝细胞内PI3K p85蛋白的表达明显减少（P<0.05）。与自然恢复组相比，药物治疗各组肝功、血脂、血糖的改善无显著差异，但肝脏脂变程度减轻，胰岛素抵抗指数明显下降（P<0.05），肝细胞内PI3K p85蛋白的表达显著降低（P<0.05）。结论 疏肝健脾方药对高脂饮食诱导的大鼠NAFLD有较好的治疗作用，其机制可
3、能是与其降低肝细胞PI3K p85的表达有关。 【关键词】 非酒精性脂肪性肝病 胰岛素抵抗 PI3K p85 疏肝健脾方药非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是目前临床上的常见病和多发病，严重影响和威胁着人们的健康。目前认为，它是遗传环境代谢相关性疾病，与中心性肥胖、脂质代谢紊乱、2型糖尿病等代谢综合征疾病密切相关1。其发病尚不能以单一的机制解释,可能为多途径、多层次损伤产生的结果，胰岛素抵抗(IR)也被认为是其重要的发病基础。以往的研究发现，疏肝、健脾方药抗脂肪肝作用的效果显著2,3。本实验从胰岛素抵抗方面入手探讨上述方药治疗NAFLD的作用效果及其机制。1 材料和方法1.1 实验动物 SPF级
4、雄性SD大鼠65只，购自广州中医药大学实验动物中心。实验动物许可证号：SCXK（粤）20052004，粤监证字：2007A010，体质量（20020）g。1.2 实验药物 柴胡疏肝散：柴胡6 g，川芎5 g，枳壳5 g，陈皮6 g，白芍5 g，香附5 g，炙甘草3 g。参苓白术散：人参15 g，白术15 g，茯苓15 g，薏苡仁9 g，砂仁6 g，山药15 g，桔梗6 g，白扁豆12 g，莲子9 g，炙甘草9 g。以上方药组成、剂量均参照方剂学4。上述药物均为三九制药颗粒剂，购自暨南大学附属第一医院中药房。1.3 饲料 基础饲料购自广东省实验动物中心，高脂饲料的组成为83%基础饲料，10%猪油
5、，5%蔗糖，1.5%胆固醇，0.5%胆盐。1.4 实验试剂 游离脂肪酸（FFA）试剂盒购于南京建成生物工程研究所，胰岛素放免试剂盒购于中国原子能科学研究院同位素研究所，PI3K p85一抗（兔抗大鼠）及二抗工作液（羊抗兔IgG）购于武汉博士德生物技术公司。1.5 动物分组与模型建立 大鼠正常喂养1周后，随机分为正常组（10只）、造模组（55只）。正常组给予基础饲料喂养，造模组给予高脂饲料喂养。12周后，随机抽取造模组5只，取肝组织做病理检测。鉴定造模成功后，将造模组随机分为模型组、疏肝组(柴胡疏肝散)、健脾组(参苓白术散)、综合组（柴胡疏肝散合参苓白术散）、自然恢复组，每组10只，用药组灌药剂
6、量据现代医学实验动物学5确定，其余各组均给予等量蒸馏水灌胃，同时除模型组继续高脂饮食外，其余均予基础饲料喂养。治疗8周后，各组动物于末次给药后,禁食不禁水12 h，用3%戊巴比妥腹腔麻醉，经腹主动脉取血，分离血清，迅速摘取肝脏，取相同部位肝右叶组织用多聚甲醛溶液固定。1.6 指标检测1.6.1 生化指标 用全自动生化检测仪检测血清ALT、AST、TC、TG、LDLC、HDLC、GLU、ApoB100，用FFA检测试剂盒检测血清FFA，血清胰岛素的测定采用放射免疫法。胰岛素抵抗指数（HOMAIR）=空腹胰岛素（U/mL）空腹血糖（mmol/L）/22.5，计算值取自然对数变换。1.6.2 组织病
7、理学检查 取固定液固定的肝组织，大小约2 cm2 cm0.3 cm，常规石蜡包埋，切片，HE 染色，光镜下观察肝脏组织学变化。1.6.3 肝细胞内PI3K p85的检测 肝组织石蜡切片用免疫组化（SABC法）方法检测PI3K p85在肝细胞中的表达及分布情况。1.7 统计学方法 计量资料以（s）表示，组间比较采用单因素方差分析，PI3K p85阳性率的比较用2检验及Fishers确切概率检验。 P0.05有统计学意义。所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。2 结果2.1 各组大鼠血清TC、TG、HDLC、LDLC的变化 与正常组相比，模型组TC、TG、LDLC较正常组显著升高（P
8、0.01），HDLC显著降低（P0. 05）；与模型组相比，各药物治疗组及自然恢复组均显著降低TC、LDLC（P0.01）及TG（P0. 05），升高HDLC（P0.05），提示调整饮食结构可能对NAFLD的早期具有重要意义。见表1。2.2 各组大鼠血清ALT、AST、FFA和ApoB100的变化 与正常组相比，模型组ALT、AST、ApoB100均显著升高（P0.01），FFA明显增加（P0.05）；与模型组相比，药物治疗组及自然恢复组ALT、AST、FFA均显著降低（P0.01，P0.05）；药物治疗各组ApoB100显著降低（P0.01），提示疏肝健脾方药可能对脂质代谢具有进一步的潜在作
9、用。见表2。2.3 各组大鼠空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数的变化 与正常组比较，模型组血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数均显著升高（P0.05）。与模型组相比，各用药治疗组及自然恢复组均可显著降低血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数（P0.05）。与自然恢复组相比，药物治疗组胰岛素、胰岛素抵抗指数均有明显降低（P0.05），提示所造大鼠NAFLD模型存在IR。见表3。表1 各组大鼠血脂的变化（略）Table 1 Comparison of the levels of blood lipid in different groups与正常组相比:*P0.05, *P0.01；与模型组相比:P0.05，P0.0
10、1表2 各组大鼠肝功、FFA和ApoB100的变化（略）Table 2 Comparison of the levels of serum ALT, AST, FFA and ApoB100 in different groups与正常组相比:*P0.05，*P0.01；与模型组相比:P0.05，P0.01表3 各组大鼠空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数的变化（略）Table 3 Comparison of FPS, insulin and insulin resistance index in different groups与正常组相比:*P0.05；与模型组相比:P0.05；与自然恢复组相
11、比:P0.052.4 各组大鼠肝组织学变化 大体观察：模型组大鼠肝脏体积明显增大，包膜紧张，色泽较正常组暗淡，整体呈苍黄色，可见局灶黄白色变性灶，质地偏硬，切面油腻。其他各组大鼠肝体积均有不同程度的增大，呈淡黄褐色，质地、弹性和韧性均较正常组略差。其中，疏肝组、健脾组、综合组要好于自然恢复组。 光镜下正常组大鼠肝脏肝小叶结构清晰，细胞索排列整齐。模型组大鼠肝小叶界限不清，肝细胞索排列紊乱，肝窦消失，出现弥漫性脂肪变性，胞浆中可见大小、数量不一的脂滴空泡，甚者脂滴互相融合，将胞核挤向一侧；小叶内炎症较重，部分大鼠可见数个炎症坏死融合成片。 疏肝组、健脾组、综合组病理改变大致相同，表现为肝细胞轻度
12、脂肪变。自然恢复组大鼠肝组织脂肪变程度较模型组明显减轻，但不如其他药物治疗组改善明显。2.5 各组大鼠肝细胞PI3K p85蛋白表达及分布情况2.5.1 PI3K p85的免疫组化结果 正常组大鼠肝细胞内PI3K p85表达很少，阳性表达率低；模型组大鼠肝细胞内PI3K p85的表达强，阳性细胞染色呈黄褐色，主要分布于脂肪变的肝细胞膜和胞浆内，阳性表达率高达90%；其他各组PI3K p85表达强度依次为自然恢复组综合组健脾组疏肝组，其中药物治疗组染色强度相似，主要分布在脂肪变肝细胞的阳性细胞率逐渐降低。与正常组相比，模型组PI3K p85表达显著增多（P0. 05）；与模型组比较，各药物治疗组
13、PI3K p85表达显著减少（P0.05），以疏肝组PI3K p85表达降低最明显，自然恢复组PI3K p85表达也降低，但差异无统计学意义，提示疏肝健脾方药有显著抑制PI3K p85表达的作用。见表4及图1。表4 各组大鼠肝细胞PI3K p85表达比较（略）Table 4 Comparison of the expression of PI3K p85 in hepatocyte in different groups与模型组相比:*P0.05A.正常组（400）;B.模型组（400）;C.疏肝组（400）;D.健脾组（400）;E.综合组（400）;F.自然恢复组（400）图1 各组大鼠肝
14、细胞PI3K p85的表达情况(SABC法)（略）Figure 1 The expression of PI3K p85protein in hepatocyte in different groups2.5.2 PI3K p85的表达与病理分级的关系 2检验相关分析表明，PI3K p85在各组中的表达强度与其病理分级存在正相关（相关系数r=0.671，P=0.000），提示肝组织脂肪变性程度越严重PI3K p85的表达越强，二者存在明显的相关性。见表5。表5 肝组织脂肪变性程度与PI3K p85表达的相关性（略）Table 5 Correlation between degree of li
15、ver steatosis and expression of PI3K p853 讨论 NAFLD是遗传、环境、代谢因素所致肝细胞脂肪变性为主的临床病理综合征。大量流行病学资料显示，NAFLD与肥胖、2型糖尿病(T2DM)、血脂异常等代谢综合征相关疾病密切相关。由于IR是代谢综合征的“共同土壤”6，故而推测IR可能也是NAFLD的发病基础。最近研究表明，几乎所有的NAFLD患者都存在周围组织和肝脏的IR 7，且IR的严重程度与NAFLD的病情进展相关8,9。 研究表明高脂环境诱导的IR伴有胰岛素信号传递通路多个环节表达或活性的异常10,11。肝细胞内的胰岛素信号转导通路主要是PI3K信号通路，胰岛素受体后信号转导通路异常是导致IR的最主要的原
