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1、热应激对慢性粒细胞白血病细胞系K562中热休克蛋白gp96表达的影响及其意义 作者：王昕，史斌，王申五，董建强，崔建英，韩淑霞 【摘要】 本研究查明不同热应激条件对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞中热休克蛋白gp96表达量的影响，为寻找增加K562细胞中gp96的提取量的最佳热应激条件提供实验依据。用免疫组织化学方法检测经38、40、42、44、46及48水浴热休克处理30分钟后的K562细胞中gp96表达量的变化；以平均阳性细胞百分率和平均荧光强度为指标，用流式细胞术研究40、44、48及52各水浴热休克处理30分钟对 K562细胞中gp96表达量的影响；利用免疫印记原理，用Western
2、 blot技术研究K562细胞经40、44、48与52水浴各休克处理30分钟后gp96表达量的变化。结果表明：免疫组织化学方法显示gp96主要在胞浆内表达，在48水浴热休克处理30分钟时，强阳性的细胞数最多，积分也最高；流式细胞术显示平均阳性细胞百分率和平均荧光强度均在48水浴热休克处理30分钟组达高峰，各温度间gp96表达量的差异有统计学意义；Western blot显示48水浴热休克处理30分钟时gp96的表达量达到高峰，各温度间gp96表达量的差异有统计学意义。结论： 48水浴热休克处理30分钟，gp96在K562细胞中的表达量达到高峰，该条件可作为提取K562细胞gp96的一个有效预处
3、理条件。 【关键词】 慢性粒细胞白血病； 热休克蛋白； gp96； 肿瘤免疫； 热应激Effect of Heat Stress on Expression of gp96 in K562 Cell Line of the Chronic Myeloid Leukemia and Its SignificanceAbstracts This study was purposed to investigate the effect of different heat stress conditions on expression level of heat shock protein gp96
4、in K562 cell line of chronic myeloid leukemia in order to provide experiment basis for seeking optimal heat stress condition increasing extraction amount of gp96 from K562 cells. The expression changes of gp96 in K562 cell line was detected by immunocytochemistry under 38，40，42，44，46 and 48 for 30 m
5、inutes in water，by flow cytometry under 40，44，48 and 52 for 30 minutes in water，by Western blot under 40，44，48 and 52 for 30 minutes in water. Immunocytochemistry assay showed that gp96 existed mainly in cytoplasm. The peak of gp96 expression was at 30 minutes after 48 in water. The result of flow c
6、ytometry was consistent to immunocytochemitry detection results under temperatures 40，44，48 and 52 (P0.01). Western blot showed that detection result was the same as the immunocytochemistry and flow cytometry detections. In conclusion，the expression of gp96 in K562 cell line reached peak at 30 minut
7、es after 48 in water. This condition may be an effective preparative condition for extraction of gp96 from K562 cells.Key words CML; heat shock protein; gp96; tumor immune; heat stress热休克蛋白（heat shock protein，HSP）又称应激蛋白，具有高度保守性，高温及其它应激因素均能诱导其表达增加，它有多个家族。近年来的研究表明，热休克蛋白gp96参与机体的固有免疫和特异性免疫（也称适应性免疫），能从两
8、大途径引发机体的抗肿瘤免疫1，为慢性粒细胞白血病的生物治疗提供了新的思路。为满足进一步的基础和临床研究需求，需有大量的gp96，而现有的提取方法效率很低，很难满足研究需要。为此，本研究欲通过免疫组织化学、流式细胞术和Western blot技术，研究不同热应激条件对K562细胞中gp96表达量的影响，寻找出最佳热应激条件，为下一步增加提取gp96的量探索预处理条件，这是进一步研究慢性粒细胞白血病生物治疗的前提。材料和方法抗体及试剂gp96大鼠单克隆抗体（大鼠抗人）为美国Neomar-kers公司产品，辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗大鼠IgG（二抗）及FITC标记的抗大鼠IgG（二抗）为美国K
9、PL公司产品，均购自晶美公司。DAB试剂盒和封闭用的正常羊血清购自北京中山生物技术有限公司，Ttiton-X100 及Tween-20均为美国Sigma公司产品，RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司。溶血素、破膜剂、BSA及流式细胞仪均为Bection Dic-kinson公司产品。BCA蛋白检测试剂盒购自美国Pierce公司，预染的蛋白分子量标准购自Fermentas公司，混合发光试剂盒为Santa Cruz 公司产品，TEMED、SDS、PMSF、甘氨酸等均购自美国Sigma公司。细胞系及培养条件细胞系为慢性粒细胞白血病K562细胞系。K562细胞系由本实验室冻存，复苏后置于底面
10、积为75 cm2的培养瓶内，加入RPMI 1640培养液及10%的胎牛血清，于37、5% CO2、饱和湿度条件下培养，24-48小时传代1次。gp96表达的免疫组织化学检测检测方法 将K562细胞培养达对数生长期后，制备成细胞悬液，调整浓度至1105/ml，等量分装后分别于38、40、42、44、46及48恒温水浴箱热休克处理30分钟后，各温度细胞用离心涂片机甩片，多聚甲醛室温固定后-20备用。将标本（各温度切片） 置于湿盒内（以下同），用 3%的H2O2 37孵育30分钟，PBST漂洗3次；0.3%的Triton-X100 37孵育30分钟，PBST漂洗3次；用封闭血清于37封闭30分钟；弃
11、血清后加1100的gp96大鼠单克隆抗体4过夜，PBST漂洗3次；加1150的HRP标记的抗大鼠IgG 37孵育30分钟，PBST漂洗3次；DAB显色。标本最后用苏木素染液复染2分钟，泡洗约2分钟、晾干，以中性树胶封片，照相。光学显微镜400倍下计数5-10个视野的细胞、阳性细胞占所计数细胞的比值为百分率。标本设阴性对照，即不加一抗，用PBS代替一抗，其余步骤同上。评分标准 不同热应激条件下，根据K562细胞中棕黄色沉淀颜色深浅、所占胞浆面积的大小分为3个等级： 浅棕色、所占胞浆面积1/2以下为弱阳性（+），积分为1；棕色、所占胞浆面积1/2-2/3为中阳性（+），积分为2；深棕色、所占胞浆面
12、积2/3以上为强阳性（+），积分为3。计算不同温度下不同阳性等级的积分总和（百分率均值乘以积分等级）及所有阳性细胞的积分总和（各等级积分相加）。gp96表达的流式细胞术检测检测方法 收获对数生长期的K562细胞悬液，等量分装为4管，分别于40、44、48及52恒温水浴箱热休克处理30分钟，将每管的细胞悬液等分入A、B两管（流式上机管），使细胞浓度为5105/ml；A管为对照管，B管为实验管，各管加溶血素固定10分钟，离心后弃上清，再加破膜剂0.5 ml固定后离心弃上清，然后每B管加入1100的一抗37恒温孵育30分钟，各组A、B管再加入1100的FITC标记的二抗37孵育30分钟。然后取出各管
13、，加入含1% BSA的PBS离心后弃上清，取0.5 ml的PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。评价标准 阳性细胞的百分率指表达gp96的细胞占所有细胞的百分率，反映表达gp96的细胞数量的多少；阳性细胞的平均荧光强度指单位细胞表达gp96的强度，反映每个细胞表达gp96的量。gp96表达的Western blot检测检测方法 收获对数生长期的K562细胞悬液，PBS洗3次后分别于40、44、48与52热休克处理30分钟，离心后加入5倍细胞沉淀体积的预冷的RIPA裂解液，旋涡震荡混合器充分混合后，冰上放置30分钟，超声粉碎机裂解后冰上再孵30分钟，离心后留取上清，-80保存备用。用BCA蛋白检测试
14、剂盒测定样品浓度，制备SDS-PAGE凝胶（本实验使用12%的分离胶），然后等蛋白总量上样、电泳、转膜、封闭过夜、杂交孵育抗体（一抗gp96稀释度1200，actin 1400; 二抗gp96稀释度15 000，actin 12 500；一抗室温孵育2小时，TBST洗3次，二抗室温孵育1小时，TBST洗3次），最后暗室中用混合发光试剂显影在胶片上，根据发光强度调整曝光时间。评价标准 凝胶成像软件分析胶片上条带的灰密度积分，用gp96条带的灰度积分除以相应泳道的actin的灰度积分，二者的比值最高表示该组刺激条件下gp96的表达量最高。统计学处理数据用SPSS 10.0医用统计学软件处理。所有数
15、据进行正态检验和方差齐性检验，复合正态、方差齐的进行单因素方差分析，差异有意义时组间差异（两两比较）采用Q检验；方差不齐时，采用秩和检验，差异有意义时进行两两比较。数据以均数标准差(XSD)、平均秩次来表示。P0.05表示差异有统计学意义，P0.01表示差异有非常显著的统计学意义。结 果K562中gp96表达的组织化学检测结果在48水浴30分钟这一热应激条件下，gp96强阳性细胞（+）的百分率均值为35%，积分总和为105，所有阳性细胞（+，+，+）的积分总和为202，均在各组中最高。在38-48之间不同刺激条件下，K562中gp96的表达量有所变化，在48组表达量最高（图1，表1）。Table 1. Mean percentage and integral of positive gp96 cells under different heat stress in K562 cell line (略)K562中gp96表达的流式细胞术检测结果阳性细胞的百分率 各组阳性细胞的百分率资料方差不齐，实验结果经秩和检验法统计处理。百分率随着温度的变化而变化，在40-52之间逐渐增高，平均秩次分别为6.00，18.80，30.08，26.40，总的来说各
